表皮生长因子ELISA检测方法的建立

表皮生长园子酶联免疫吸附试验检测方法的建立罄墨掣乏絮鉴糕 霪羹鋈囊 霾霾塑鬟黧鏊ELISA羹鋈羹羹鬻囊嚣 爨囊测慰西觏；巍掣髫ELISA!}直l矧鎏赢二墨笺EGF嚣职囊《撼静＆黪嗡兹； 嚣裾弱嚣越臻舾期rhEGF磐妻蠹蓠习裂蕊若巍矮密，裂巍戮莪豢嚣羔懿ELISA(曩 浸嚣珏ELISA；一嗝一籀镉镭瓣ELISA)爱独EGF，霖墨蔫帑糕蕊滔堵磊璀堪溻遑 再美丽羁l／LH2sOt (注： 鼠IsA溶液静酝翻觅筵二帮分) 2．2方法 2．2．1抗rhEGF多克隆抗体的制备 1)戳rh黼F鞭白为抗原，取成年雄性新西兰大白兔4只，在辩其进行撼础 免疫前采墩斑清备用，睫聪进行免疫。 2)2．5m1无菌双蒸水溶解1mgEGF，然后与2．5ml的完众佛氏後剂充分混合 成掣I状物 3)第一次免痰：1m1／熙兔子，每个前肢注射0．5ml 兔爨碘溪潺毒被注瓣簿霞{l蓼菠，曩l娃瀵毒懿注射嚣旋下注冀重，壹裂鼓起 一乳白色小包。继续喂养，一个月厝第二次免疫。 4)第二次免疫：l燕l／袋兔子，每个爱簸注瓣0。s瑶l，方法露第一次免疫， ～个星期詹试血。 2．2。2藏斑清静收集帮分离 将大囱咔寰彩占?锓掷?将大囱兔仰卧嗣定，心脏穿刺点刮毛，消毒皮肤，50ml灭菌注射嚣进行心 ?? ?x 表皮生长圈子酶联免疫暇附试验检测方法的建立及韧步临珠应用 3)阻断反应：采用根外阻断模式：将一定浓度32，16，8。4，2，1，0．5， 0，25ng／mlrhEGF50#i／魏，1：10万耩释度弱rhEGF撬盘瀵50#1／魏攘灭酶橼叛， 加入没宵包被rhEGF但已用封闭液封闭的W靛板i0攀圜滩清罐!：374C；抗皿§≤； 杂匿虢嚣j委f搿潲毽强灞灞摅原抗体结合率睫麓下降。 Fig．2—2：standardcurveofthemeasure瞻entofrhEGF 一·一 赡E弹浓发 2．3．2对rhEGF抗血清纯度和特异性的检测 抗rh F抗血清纯度和特异性的检测抗rhEGF多抗血清缀饱和硫酸铵分级沉淀法纯化后，A。nm和A。。哪光吸收 ?? ?x 表皮生长瓣予酶载免疰暖辩试验硷测方法酶建立及裙步牾寐应麓 (1)批内误差：每～样品浓度作4次熏复，以其批内变异系数表示批内 误麓。 (2)批间误差：重复步骤7操作，连续3次，以其批闻变异系数表示批间误 差。 3．2．2单抗一多抗夹心ELISA基本程序 3．2．2．1标准品和质控样鼎的制备 冻干的重组hEGF购囱深圳华生元基因工糨有限公司，用抗原稀释液溶解并 醚铡成浓度为0．8mg／ml的标准赡存液，小鬃分装存于一80"C备用。标准晶在检溅 蠹蓼瓣撬藤耩释滚凝鲜鬣麓，储存蠢准晶最终怒镬浓度旁125，250，500，1000， 2000，4000和8000pg／ml。质控品由标准储存液通过抗原稀释液稀释为 4000pg／ml，检测时用抗原稀释液稀释为250，1000和4000pg／ml的浓度。质控 品和标准品均存于一80℃。 3．2。2，2包疆撬体及揍纛瀵王终浓度鳃选撵 采羽摸盘滴定法，识被荦抗采用lOug／ml，5ug／ml，2。sug／ml3个浓度；多 抗漾用40，20，i0，5ug／ml4个浓度；rhEGF采用0，25～8ng／ml系列倍比稀释。 酶标=抗的工作浓度为1：8000。 3．2．2。3夹心法的ELISA蒎本操作过程 1)酝被：戳0。05M，pH9．5辩‰e逸一NaHCO。缓狰滚壤5#g／ml魏rhEGF包较酶耩投， i00Hi／孔，4"C，澄盒内包被过夜。 2)封闭；用0．05％Tween-20的PBS(PBST)洗涤3次，拍干后加i5％小牛血清 的PBS封闭，300ul／孔，37℃，lh，然后用PBST洗涤3次。 3)按上述浓度秘入i00#l／孑L标准晶，矮羧鼹及待捡测群品，麓佟复琵。酶标 羧巍霆温瓣弯2hr露矮0。05％Tween-20豹PBS(P酷{)洗涤3次弗撼予。 4)以棋盘滴定选定的多抗浓度在每个酶标张中加入i00p1多抗，酶标板在室温 孵宵lhr后用0．05％Tween一20的PBS(PBST)洗涤3次并拍干。 5)加酶标二抗：PBST洗涤3次后加l：8000稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗 兔IgG，100驻I／魏，璧澈孵毒强。 6)PBST洗涤4次后，加酝剖的底物液TMB和H202各的ul／孔，37℃15min。 7)终止反应：加入2MH。S04，50ul／孔。 表皮生长因子酶联免疫I簸附试验检测方法的建立及初步临床成用 8)测On。。：置MK2酶标仪测定450nm波长的OD值。 3，2。2。《绫整范鋈 以rhEGF浓度对450nm吸光魔德绘图，绘制标准曲线。通过标准曲线求质控 及待测样品的浓度。 3。2．2．5矮控品检测戆精密度器缕确发评徐 准备3个标准储存液及1个4000pg／ml的质控样品。每天针对1个标准储存 液(稀释后获7个标准值)作标准曲线，每次作两个标准曲线。作每一标准曲线 均俸3令滚廑豹矮羧襻晶，每一浓麟祥鑫缘痒复魏。连续3天霹褥6条标准瓣线。 精密魔以％RSD(相对标准偏差)表求，准确度以％RE(相对误麓)表示。精密度 和准确魔以质控样晶捻测结果计算。 3，2．2．5蕨控撵鑫戆稳定毪译俊 观察质控检测值在质控标定慎士2SD时的最大冻融次数。 3．2．3线性评价 鼹楚浓度襻本黪蕊魄嚣释惹魄较溅定篷与预期篷。 3．2．4检测方法的稳定性实验 取商、中、低浓度EGF的三份脏清标本，予同一批内各测定10次，计算批 蠹变劈系鼗；在不阉梭溅窭冬溅定6次，诗篓拯耀变募系数。 3，2．5阐收实验 于融知EGF浓度的正常混合胤清标本内各加入系列浓度的EGF(50、25、 12．5ng／mt)，遘霉亍必，§ELISA测是，计算回收率。 3．3结果及分析 3．3．1阅续竞争ELISA梭测方法的戆果及分爨 3．3．1．1多抗和包被抗原最佳浓壤的筛选：方阵滴定结果见袭3一l 从液3一l及2可见。当OD490。值接近1．0时，抗EGF多挽的稀释度为1： 128000。故实验采用l，OO韭g／ml为馁被抗原的工终浓度，l：128000为多抗瓣工 作浓度。毡被抗原浓度参考文献。 3．3．1．2抗EGF多j宄饱和浓度的精确值：方阵滴定结果见袭3，2 从袭3—2看到：多抗的精确稀释度为l：10万，此浓度所得的灵敏度嵩，同 表皮生长因子酶联免疫吸附试验检测方法的建立及初步临床应用 时也满足了零抑制的OD490nm值达到1．3，接近1．0同时接近粗筛稀释度以及易 于稀释。 EGF．PcAb EGFl，20001／40001／8000l／16 1／32 1／64 1／128 1／256 l／512 1／1020 ug／m1 工 千 ； 千 千 千 4i l 3．323 3．092 3．130 31003173 2．576 l925 I．249 0667 0．3100．039 l 301l 2．907 2．93I 29572．616 2362 1．973 l 010 0．606 0_3100．036 1／64 1／128 1／256 l／512 1／10241／20481／40961／8192l／16001，3200 年 千 千 工 工 j二 工 i 万 0万 l 2296 l 0320．609 0．380 0．285 0．158 01190078 0069 0．0560048 1 2．344 1．086 0．619 0404 0295 016501140．069 0062 00600051 表3-1；多抗和包被抗原最佳浓度的筛选 BGF．PcAb EGF1／5 I／6 l广7 1／8 1／9 1／10 1／11 1／12 1／13 1／14 空 ng,／rnl万 万 万 万 万 万 万 万 万 万 白 100000．245O．2140．187O．16801490．135O．12l0．0950．0870．0650．047 looO0，3920．3580-3140．2930．2220．2120．2020．2080．191O．1860．045 100 0．6140．5570．5260．4980．4620．4020．3920．4010．3850．352．0460 10 0．9980．8250．7830．7450．691O．6180．6000．5890．5810．573．0460 l 1．20l1．1941．20l1．1551．0971．0601．02l1．0221．0100．9930．043 O．1 1．4211．3601．3071．2241．1961．1451．1401．132 1．1251．123O．046 0 1．5491．4351．3951．3521．3081．3001．3011．2271．2561．2240．046 表3-2：抗EGF多抗饱和浓度的精确筛选 3．3．1．3阻断时间和温度对测定结果的影响从图3-1可知：在370C反应更快 达到平衡。为了节约时间，采用370CI小时为最佳阻断反应温度和时间。 表皮生长因子酶联免疫吸附试验检测方法的建立及初步临床应用 图3-1：温度和时间对阻断反应的影响 一●一 250C—-一370C 3．3．1．4ciELISA标准曲线的建立 3．3．1．4．1EGF的ciELISA检测：所得结果见表3．3、图3．2。 从表3-3可知当[EGF]达到0．5ng／ml时，OD450nm值与0ng／ml时的 OD450nm值出现明显差异，故检查限为0．5ng／ml。 【EGF】rig／m! OD450响 ％B／Bo 32 0．516 39．69 16 0．548 44．10 8 0．639 52．95 4 0．764 61．88 2 0．913 73．36 1 1．060 80．19 O．5 1．162 91．69 0．25 1．289 98．92 O 1．300 loo．OO 表3-3：ElF的ciELIsA检测结果 以表3-3的(％B／B0)对Lg(EGF)进行回归分析，得到一条回归直线(回 归方程为y=．0．1281Ln(x)+O．8116，相关系数R2=0．9938，其中Y为(％B／B0)，x 为Lg(EOF)。从图3·2可知：在O．5ng／ml-32ng／ml之间，曲线呈良好的线性关系， 且曲线的斜率较大，故检测范围为0．5ng／ml-32ng／ml。 表皮生长因子酶联免疫吸附试验检测方法的建立及初步I临床应用 120．00％ 100OO％ 80．00％ 60．00％ 40．00％ 2000％ 0．00％ 01 l i0 100 Lg[EGF] 图3-2：ciELISA检测的标准曲线 陋Ml板间黧结A板鬣嚣率SD 各浓度板间变 异系数 总的板间变异 系数 32 4 0．5 O 41．27 39．72 41．69 4510 44．23 47．25 54．38 50．31 48．22 65．24 57．68 59．83 6722 73．6l 76．89 78．96 8267 85．84 94．07 88．18 91．16 98．76 100．04 1032l 40．89 1．04 2．5 45．53 l_55 3．4 5097 3．13 6l 6092 3．90 6．4 4．36 72．57 4．92 6．8 8249 3．45 4．2 9l14 2．95 3．2 100．67 2．29 2．3 表3-4：ciELIsA标准曲线批间误差 42 (％一料器嚣 表皮生长困子酶联免疫吸附试验检测方法的建立及初步临床应用 蛭5ug／ml趸；EGF珀0。25～8ng／ml与疗夔：A450nm勤0。{i～l?51￥象j稽短樽 蕈镟， 1．3，2÷2强硎獭皤 稻渊一连垮谢碴蓄臻ELISA里程iEGF憾m痿萌嚼薹“冀蘩篱嚣j誊醚蒸荆 鲤划型溜塞壅焉憾忱磊躞墨；鞲箬晕错矧R2—0÷9971；{；；}盆堡受酣0j|i女～ 8ng／度越低 ，则EGF和EGFR阳性率越高。BorrmannIII、Ⅳ型(浸润型)的EGF、 EGFR和二者同步表达阳性率均比I、II型(局限型)明显增高。sugiyama等。” 亦同样的结论。onda等。”报道硬癌中的EGF和EGFR与EGFR共同表达的阳 性率明显高于髓样癌，说明EGF及其受体是刺激胃癌纤维化的因素，其机制可能 与胃癌的 自分泌和旁分泌有关，胃癌细胞产生的EGF不仅作用与癌细胞本身，而 且作用于癌细胞周围的成纤维细胞使其合成胶原，产生大量纤维组织，形成预后 较差的硬癌”1。Yone叫ra等⋯1报道侵犯粘膜下层，肌层和浆膜下及浆膜胃癌的 EGF、EGFR及二者同步表达的阳性率呈递增的关系，进一步证明EGF及其受体表 达阳性的 胃癌有更强的侵犯性。Yasui等⋯1报道有胃周淋巴结转移胃癌EGF阳性 率为60％，而无转移组为35．6％，这是因EGF除了能刺激癌细胞生长外，还具 有免疫抑制作用，更易发生淋巴结转移，总之，EGF和EGFR的表达可作为胃癌 患者生物学恶性程度的一个标志。Tahara等。”首次报告EGF与胃癌预后的关系， 16例EGF阳性的病人均在术后18个月内死亡，而65例阴性者28例存活期超过 18个月。Onda等。“发现早期胃癌EGF阳性和阴性病人的5年生存率分别为83％ 和96％：进展期癌分别为16％和47％。Y0nemura等9”报道III期胃癌病人中，18 例EGFR阴性的5年生存率为6l％，而8例阳性者为25％。综上所述，提示肿瘤 组织中EGF及其受体的表达可作为评估胃癌患者预后的指标。本研究资料表明， 胃癌患者血清EGF含量有所增加，但与正常人相比其差异朱见统计学意义。刘光 明等9”认为胃癌患者神经体液的改变虽然可能刺激颌下腺EGF分泌或胃癌细胞 有EGF自分泌现象，但均为局部的EGF含量变化，尚不能引起血中EGF含量的明 显升高。 袭皮生长髑乎酶联免疫吸附试验检测方法的建立及初步临床应用 3．3．2。4线毪评价 用离浓度样本作倍比稀释后bB较测定值与预期值可见，该检测方法有良好的 线性。结果觅表3—7。 表3—7：测定方法静线性译徐 3．3．2。5精密度 取蕊、中、低浓度EGF静三份血清标本，作夹心ELISA测定，于霞一批肉各 测定lO次，批内变异系数(cV)为4．75～7．50％，平均批内CV为6．54％；在 不同检测日各测定6次，批间变弊系数为7．49～12．92％，平均舷闻cV为lO．79 ％，说明本课组制备的试裁盒稳定性良好。 表3-9：批间c1，测定 3。3。2。6露牧搴 于两份已知EGF浓度的混合血清标本(n=10)内加入系列浓度的EGF(50、 2S、12．5ng／m1)，逶学夹心ELISA溪||定，诗筹戮浚率秀91。4～95。2％，平均嚣 收率为93．8％，说明本课题组建立的试剂盒有较高的检测准确魔。 表皮生长因子酶联免疫吸附试验检测方法的建立及初步临床应用 表3一lO：回收率的测定 3．4讨论 3．4．1ELISA方法的比较选择 间接竞争法成功的关键在于反应体系中抗体浓度的确定，第一次方阵滴定中 倍比稀释多抗是大范围搜索可适浓度，第二次方阵滴定中稀释单抗是小范围确定 最佳浓度，这样低浓度的EGF便能竞争下来，使OD。rli]l值下降，否则抗体过饱 和则竞争不下来，OD；s。flm值无明显变化。在ELISA反应中，由于包被抗原比样品 中的抗原更易与抗体结合，故实验中先将样品同抗体在板外反应一段时间后，再 加入包被好的酶标板中，以便使样品与包被抗原具有同等竞争力，检测结果更准 确。实验结果表明，间接竞争法有较高的敏感度，本研究建立的EGFciELISA曲 线可应用到临床尿液样本或细胞培养上清夜的实际检测中，检测成本要低于单抗 一多抗夹心ELISA法。 国外有试剂盒采用双单抗夹心法，该法需制备两个针对抗原上不同表位的单 抗，其中一个用于包被固相载体，另一个用于制备酶结合物。由于本课题研究中 针对另一表位的单抗效价不高，同时该方法必须制各酶结合物(对酶结合物的纯 化较复杂)，故本研究采用单抗一多抗夹心法。该方法以单抗包被的方式捕获抗原， 性能稳定重复性好，只占用一个抗原表位，再用不同种属动物的多抗定量、酶标 二抗显色的间接放大，提高了检测的灵敏度，可用于临床低含量样本的检测。 3．4．2抗原抗体的包被 良好的酶标板吸附性能好，空白值低，孔底透明度高，各板之间、同一板各 孔之间性能相近。由于原料的不同和制作工艺的差别，各种产品的质量差异大， 为了保证实验结果的一致性，应该使用同一厂家、同一批次的酶标板。包被固相 载体的抗体应具有高亲和力和高特异性，可取材于抗血清或含单克隆抗体的腹水 袭皮生长因子酶联免瘴吸附试验检测方法的建立敷初步临床应用 或培养液。如免疫用抗原中含有杂质，在抗血清中将出现杂抗体，必须出去后才 能用予ELISA，以保证试验的特异性。因此抗血清不自B直按用于包被，应先提取 IgG。腹水中单抗的浓度较高，特异褴亦较强，一般W将腹水作适当稀释后直接 毹被，如需更高的敏感度剡需用纯他的IgG。应用单抗包被时成注意，一种单抗 板针对一个抗蒹表位，在蘩整情况下，甭多稀革抗混合包被，可能会取得更好的 效果，因尧它可§§会据褰撬纛攘获缝力。多耱撬俸混合必矮弄清楚是否锌对抗原 螅不疑表霞，若是键对同一表位，灵《产生警缘效应；镑对攀因袭位黪产生攘加效 殿。但是，增加抗原搬获黢力同时，楚以占用更多的抗原使点必代份，这又会影 响第二抗体的定魑效果，可能会牺牲灵敏度。 对包被浓度的确定，均采用方阵滴定法，当包被抗体浓度低时，随包被浓度 的增加包被蓬增大；当包被抗体达到一定浓度后，包被量为定使，不再随浓度的 增粕而增大，l觅浓度称为饱和包筱浓缱。一般来说，溺包被浓度稍大或接近饱和 浓度嚣孪，壹于抗嚣i或撬钵己不秀是包被孛静疆锱因予，试验标准差较小；丽当镪 拔浓度与魄葶鞋浓度挺繁较太时，试验搽准蓑耀对较大。医冀本实验选耀键饔篷辕 浓度。 3，4．3夹心ELISA灵敏度的制约因素分析 3．4．3．1抗体的包被 将特定的抗原或抗体吸附于圃相上，魑进行固相免疫测定分析的前提，且后 续浏定结采的好环，予免疫分子阐相化状况密切相关。蛋自质与聚苯乙烯阐相载 髂是逶过耪疆啜酣结台的，靠静怒蛋囱震分子络梅上的巯水基窝与固相载体表瑟 的臻拳基因阉懿佟角。这静携理啜黠燕≤≥黪冥毽鳃，受蛋自覆戆分子漂、等亳点、 浓度等的影响。载馋对不同蛋白鹱的吸孵懿力是不攘圊夔，大分子蛋白质较枣分 子蛋白质通常含商更多的疏水基团，故更易吸附到固姻载体表麟。IgG对聚苯乙 烯等固相具有较强的吸附力，其联结多发生在Fc段上，抗体结台点暴露于外， 因此抗体的包被均采用直接吸附法。 抗体与固相载体鼹通过非共价吸附结合的，吸附盾易发生解离，如果不采取 迸当静箍瑾，势努弓|起结合有捡裔紧，使懿石的每步操作_遭程中，结合不綮 黪捷俸麓落下来并与黠瘦静免疫反应物竞争结合，簌褥洚低测定靛灵敏度和耩密 度。避熟包被物瓣离黪簿易搓藏是：(1)确定最逶鳃抗体镪缓浓度；(2)镪被教 47 表皮生长困予辩联免疫啵附试验检测方法的建立及韧步临床应用 以后的每步反应后进行彻底洗涤。 当蠢羧篷薮效采不锺，霹戮采惩阂接瓣播获魁被法，浆震二抗竣蛋鸯轰一抗 体间接吸附方式或亲和素一生物素化抗体间接吸附方式，提高抗体的包被效果和 槛躯，绫改善抗藤抗体绪念反应憩力，祆瑟提高稔澜灵敏艘，重爱往齐谴。 3．4．3．2抗原抗体的最适比例 抗灏抗体反暾对如果抗原或抗体极度遗剩，剐无沉淀物形成，程免疫测定中 称为带现教。抗体过量称为前带，摭原过爨称为詹带。在用免疫学方法测定抗原 时，应使反应系统中有足够的抗体麓．否则测得的爨可能会小于实际含量，甚至 擞现假阴性。 在建立ELISA方法的过程中，通过对包被抗原或抗体与加入抗体或抗原工作 浓度鲍选挺，可以尽可筑找銎l挽凝一挽嚣戆最逶eI绷，这是残功建立方法黪关键 之～。 3，4。3．3撬爨获傣戆特冀瞧 抗原抗体的缩合实际上只发生在抗原的衷位与抗体的抗原结合位点之悯。由 予两者在纯学结搦器空阗梅登上璧互替关系，瑟戳撬琢撬体反应吴商毫废的特异 性。但是这种特异性不是绝对的，假如两种化合物有着部分相同的结构，在抗原 摭体反应中可出璇交叉反藏。速撼的是，零研究蠹予经费酌原因未避行EGF类议 物的交叉反应试验。 3．4．4ELISA检测搡作过糨对实验结果的影响 ELISA试验以灵敏度较高、特异性较好的特点在临床上褥到了广泛的应用， 僚操作中的各个环节对试簸的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色不 全、花板等结果。现将操僚孛各个环节注意事项总缝于下： 选择试剂：选择质量优良的检测试剂，严格按照试剂说明书进行操作，操作 熬涛试裁在室湿下平餐30-60分钤。 加样： 1．标本为血清；最好将血液先自然存放1-2小时后，再用3000rmp 褰心15分镑；挺本鸯盘浆：盛矮健嗣含撬凝裁豹毂滚标本收集管，采盘基必须 立即颠倒采血管混合5—10次，放鬣一段时间后，3000rpm离心15分钟；若在几 天肉检测，霹放程2-8’C踩耱中，簧要贮存，粥置予一20℃酌低温球箱肉。2．热 样后及时放入孵箱。 3．加酶试剂厢用吸水纸在酶标板表面轻拭吸干，以擦干外 表皮生长因子瓣联免疫吸附试验检测方法的建嶷及翔步临廉应用 溅的酶结含物。4．如果采用AT或其他全自动加样，最好选择FAME或其他厢处 溪纹器麴薅试裁。5。标本较多霹，应分懿操作。 孵育：1．孵育时贴封片或加蘸，以防标本蒸发；2．按说明步骤严格控制操 佟时闯，潋防菲特髯渡酣豹蹭掬。 洗扳：L保证洗液注满各孔，洗板针畅通，洗完板后最好在吸水纸(选择 干净、无躐少尘的吸永材料)上轻轻拍干； 2．合联安排，绒多用凡台洗较机。 以防反应板过多导致孵育时间延长。 显色：i．显色剂尽激在临用前配制，坚持不用过期显色剂，肉眼可见浅蓝 戗的TMB照色剂不用；2．加样时保持显饿裁不终流； 3。A、B波应避免接触 垒属器械。 终止；热终止渡嚣重澎避免产黛气遗，产生鞍多气逸，导致援鞭经壤妻羹。 读板：应保诞酶标板清洁。 在实舔撵露中，除了逡撵霞赵试裁终，必矮严榛按照搽箨步臻进行捺锋，霜 时作好室内质控、室间质评，以严谨的工作作风检测每～份标本，才能保证检测 璇璧。魏在莓内基霄稳当数量酶擎经捐有全垂动酶标便，这对予实瑷ELISA标准 化检测、提高检测质量起到了重要作用。