5种中草药对凡纳滨对虾生长及非特异性免疫功能的影响

基金项目 科技部社会公益研究专项(2004DIB4J1659)。 作者简介 王芸(1981-),女,河南南阳人,硕士研究生,研究方向:水产 药理学。*通讯作者,E!mail:Lijian@ysfri.ac.cn。 收稿日期 2007!06!23 对虾养殖中寻找更加绿色环保的免疫调节剂具有重要 的意义。中草药具有天然、高效、毒副作用小、抗药性不显著、 资源丰富以及性能多样等优点,既能提高水产动物性能和饲 料利用率,又能防治水产动物病害,是其他禁用抗菌素和化 学药物的替代产品,在水产养殖应用中越来越受到人们的亲 睐。目前关于中草药作为免疫调节剂应用于水产养殖已有报 道[1-2],但是适合凡纳滨对虾的中草药免疫调节剂的报道并不 多。该试验通过在配合饲料中添加相同浓度的5种中草药, 对其生长及非特异性免疫指标进行测定,旨在筛选出促进生 长和调节凡纳滨对虾非特异性免疫功能的中草药。 1 材料与方法 1.1 药饵的配制 鱼腥草、黄芪、大黄、甘草和黄芩均购自 青岛市同仁堂药店。称取干燥、切碎的鱼腥草 100g放入 1 L的烧杯中,加水浸泡过夜,次日煎煮 3次,集中 3次药液 定容至500ml,取200ml与2kg全价配合饲料(基础饲料, 金海力公司生产)混匀,后用小型颗粒饲料机分别制成药 饵,相当于饲料中含鱼腥草 2%,烘干备用。黄芪、大黄、甘 草和黄芩的药饵均按此法制备。 1.2 对虾选择及饲养管理 凡纳滨对虾(Litopenaeusvanna! mei)购于青岛市崂山区东海湾对虾养殖厂。试验用虾选择 健康、大小均匀,体长11.73cm±0.03cm,体重9.2g±0.1g。暂 养3d后分成6组,分别是鱼腥草组、黄芪组、大黄组、甘草 组、黄芩组和对照组,每组40尾,设3个平行。饲养于100L 海水的PVC桶中,24h通气饲养;每天投喂3次,均为饱食 投喂量;水温维持在20～22℃,每天换水1次,每次换水1/3。 1.3 对虾血清获取 在试验开始的第 1、4、7、14、21、28d 取血。取血时用 1ml注射器自对虾头胸甲后插入心脏抽取 血液,每桶取5尾虾的血液合并置于无菌Eppendorf管,4℃ 冰箱保存,待血液凝固后,5000r/min离心 10min即得血 清,-70℃保存。 1.4 对虾生长测定 试验开始时,随机取 50尾对虾测量 体长体重,饲养试验结束后,每组对虾分别测量体长和称取 体重,计算体长增长率、相对增重率。计算公式如下: 体长增长率(%)=[(试验末体长-试验初体长)/试验初体长] ×100 相对增重率(%)=[(试验末体重-试验初体重)/试验初体重] ×100 1.5 非特异性免疫因子的测定 溶壁微球菌(Micrococusly soleeikiticus)购自于 Sigma公司。血清溶菌酶(LSZ)活力、酚 氧化酶(PO)活力按改进了的 Ashida[3]和 Hulmark[4]方法测 定,血清蛋白含量采用 Boardford法测定。超氧化物歧化酶 (SOD)活力的测定采用试剂盒的测定方法,SOD酶活力单 位定义为 1ml反应液中 SOD抑制率达 50%时所对应的 SOD量为1个活力单位。 5种中草药对凡纳滨对虾生长及非特异性免疫功能的影响 王芸 1,2,李 健 2*,刘 淇 2,王 群 2 (1.上海水产大学生命科学与技术学院,上海 200090;2.中国水产科学研究院黄海水产研究所,农业 部海洋渔业资源可持续利用重点开放实验室,山东青岛 266071) 摘要 [目的]筛选促进生长和调节凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)非特异性免疫功能的中草药免疫调节剂。[方法]分别采用质量分 数为2%的鱼腥草、黄芪、大黄、甘草和黄芩的水提取物饵料连续28d饲喂凡纳滨对虾,在不同时间取样,测定血清中的酚氧化酶、溶 菌酶、超氧化物歧化酶和血清蛋白含量等免疫因子的活性。[结果]结果表明:饲喂黄芪、大黄和甘草的各组增长率和相对增重率显著 高于对照组(P<0.05);除个别情况外,黄芪、大黄、甘草和黄芩组的酚氧化酶活力、溶菌酶活力、超氧化物歧化酶活力和血清蛋白含量 均极显著高于对照组(P<0.01);黄芪、大黄和甘草能够促进凡纳滨对虾的生长及非特异性免疫功能,鱼腥草则相反;饲养试验结束后 第7天,腹腔注射鳗弧菌进行攻毒试验,在7d内,鱼腥草组累计死亡率高于对照组;黄芩组累计死亡率与对照组相同,黄芪、大黄和 甘草的累计死亡率均低于对照组,免疫保护率为37%~46%。[结论]从促进生长、提高免疫功能这两方面考虑,黄芪、大黄和甘草是适 合凡纳滨对虾的中草药免疫调节剂。 关键词 凡纳滨对虾;中草药;生长;酚氧化酶活力;溶菌酶活力;SOD酶活力;非特异性免疫 中图分类号 S966.12 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2007)26-08236-04 ffectofFiveSpeciesofHerbsonNonspecificImmuneActivityofLitopenaeusvannamei WANGYunetal(CollegeofLifeSciencesandTechnology,ShanghaiFisheriesUniversity,Shanghai200090) Abstract Litopenausvannameiwerefedfor28dwithwaterextractsfrom2%weightratioofHouttuyniacordata,Radixastragalus,Rheum officinale,GlycyrrhizauralensisandRadixscutellaria.Serumswerecollectedindifferenttimesandtheactivitiesofphenoloxidase(PO), lysozyme(LSZ),superoxidedismutase(SOD)andproteinlevelintheserumofL.vannameiweremeasured.Thebodylengthgrowthrateand relativeweightgainofR.astragalusgroup,R.officinalegroupandG.uralensisgroupweresignificantlyhigherthanthoseofcontrol(P<0.05). Withfewexceptions,thePOactivity,LSZactivity,SODactivityandserumproteincontentofRadixastragalus,Rheumofficinale,Glycyrrhiza uralensisandRadixscutellariaweresignificanthigherthanthoseofcontrolgroup(P<0.01).ResultshowedthatR.astragalusgroup,R.officinale groupandG.uralensiscouldpromotethegrowthandnonspecificimmuneactivityofLitopenausvannamei,butH.cordatawasonthecontrary. VibrioanguillarumwasinjectedintoLitopenausvannameithe7thdafterthefeedexperiment.ThecumulativemortalityofHouttuyniacordata groupwashigherthanthatofcontrolgroupin7dandthatofRadixscutellariagroupwasthesamewithcontrolgroup.Thecumulativemortalityof Radixastragalus,RheumofficinaleandGlycyrrhizauralensiswerelowerwithimmuneprotectiverateof37%~46%.Therefore,Radix astragalus,RheumofficinaleandGlycyrrhizauralensiswereherbimmuneregulatorssuitedforLitopenaeusvannameiconsideringfromthe aspectsofpromotinggrowthandimmuneactivity. Keywords Litopenaeusvannamei;TraditionalChineseherb;Growth;Phenoloxidaseactivity;Lysozymeactivity;SODactivity;Nonspecific immuneactivity 安徽农业科学,JournalofAnhuiAgri.Sci.2007,35(26):8236-8239 责任编辑 曹淑华 责任校对 王 淼 2.2 5种中草药对凡纳滨对虾血清酚氧化酶活力的影响 (图 1) 投喂 5种中草药后,凡纳滨对虾血清酚氧化酶活 力有明显提高。鱼腥草组、黄芪组、大黄组、甘草组、黄芩组最 高酚氧化酶的活力分别达到0.0065、0.0063、0.0088、0.0087、 0.0063U/ml,且约在第 14天达到最高;而投喂 5种中草药 后第4天到第14天,血清酚氧化酶的活性力与投药前相比 均差异极显著(P<0.01);在第21天除鱼腥草组之外,各试验 组与对照组之间差异极显著(P<0.01),第 28天除鱼腥草组 血清酚氧化酶明显低于对照组且差异极显著(P<0.01),各试 验组与对照组之间无显著差异(P>0.05)。结果显示,黄芪、大 黄、甘草和黄芩均能显著增强PO的活力,而在试验后期(第 21天、第28天)鱼腥草抑制了PO的活力。 2.3 5种中草药对凡纳滨对虾血清溶菌酶活力的影响(图 2) 中草药的凡纳滨对虾的血清溶菌酶活力有明显提高。 对照组血清溶菌酶活力 0.056～0.009U/ml;鱼腥草组、黄芪 组、大黄组、甘草组、黄芩组溶菌酶的活性最高分别达到 0.080、0.112、0.166、0.124、0.037U/ml;而投喂鱼腥草、大黄 和甘草后4d,溶菌酶的活性与投药前相比就有了显著差异 (P<0.05),且投喂黄芪、大黄和甘草后7d和 14d与对照组 之间有极显著的差异(P<0.01);但在试验后期各试验组溶菌 酶活力均有大幅度下降且与对照组之间差异显著(P<0.05)。 2.4 5种中草药对血清超氧化物歧化酶活力的影响(图3) 投 喂大黄、甘草和黄芩的凡纳滨对虾的血清SOD酶活力明显提 高。对照组血清SOD酶活力为409.7～256.02U/ml;鱼腥草组、 黄芪组、大黄组、甘草组、黄芩组SOD酶的活力最高分别达 到 501.5、420.1、475.6、431.7、458.1U/ml;而投喂大黄、甘草和 黄芩后7d和14d,SOD酶的活性与投药前相比差异显著(P< 0.05),但此期间黄芪组SOD酶活性低于对照组,且与投药前 相比差异显著(P<0.05);在试验后期除甘草组仍与对照组之 间差异显著之外(P<0.05),各试验组与对照组之间无显著差 异(P>0.05)。 2.5 5种中草药对凡纳滨对虾血清蛋白含量的影响(图 4) 投喂中草药 4d后,凡纳滨对虾血清蛋白含量明显提 高。对照组血清蛋白含量为 328.6～58.2U/ml;鱼腥草组、黄 1.6 攻毒试验 试验结束后,每组取 15尾对虾用鳗弧菌 (Vibrioanguillarum)进行攻毒,攻毒前鳗弧菌在对虾体内分 别传代3次,预试验确定鳗弧菌的攻毒浓度为1×108cells/ml, 注射剂量 50μl/尾,预试验证明,攻毒后 7d左右对虾的死 亡趋于稳定,故该试验记录攻毒后 7d内各组的累计死亡 率,并计算相对免疫保护率(RelativePercentSurvival,RPS): RPS(%)=(1-免疫组死亡率 对照组死亡率 )×100 1.7 统计分析 以上非特异性免疫因子的数据用SPSS13.0 统计软件进行处理,用 ANOVA的方法进行分析。当差异显 著(P<0.05),用Tukey’s检测法进行均值间多重比较。 2 结果与分析 2.1 5种中草药对凡纳滨对虾生长的影响(表 1) 投喂含 有黄芪、大黄和甘草的饲料后,凡纳滨对虾的增长率和相对 增重率均有明显提高。试验结束后对照组的增长率为1.79% ～1.95%,相对增重率为 18.5%～20.7%;而大黄组的增长率 达 5.47%,相对增重率达 29.3%,与对照组相比差异显著 (P<0.05);黄芪组也有类似的变化。而鱼腥草组则恰恰相反, 增长率低于对照组,且与对照组之间差异显著(P<0.05)。黄 芩组与对照组之间没有明显差异(P>0.05)。 表1 5种中草药对凡纳滨对虾生长的影响 注:**表示试验组与对照组之间差异极显著(P<0.01);*表示试验组与对照组之间差异显著(P<0.05)。 组别 初始体长∥cm 终末体长∥cm 增长率∥% 初始体重∥g 终末体重∥g 相对增重率∥% 对照 11.77±0.28 11.98±0.35 1.87±0.08 9.2±0.3 11.0±0.7 19.6±1.1 鱼腥草 11.71±0.30 11.83±0.23 1.00±0.21* 9.4±0.2 11.1±0.6 17.7±2.2 黄芪 11.69±0.32 12.23±0.30 4.90±0.36** 9.2±0.6 11.8±0.4 28.5±0.6* 大黄 11.71±0.29 12.31±0.31 5.47±0.23** 9.2±0.3 11.9±0.6 29.3±1.0* 甘草 11.71±0.29 12.10±0.35 3.24±0.45** 9.3±0.5 11.3±0.8 21.9±2.2 黄芩 11.76±0.19 11.94±0.31 1.79±0.82 9.1±0.7 11.1±0.8 22.0±1.1 王 芸等 5种中草药对凡纳滨对虾生长及非特异性免疫功能的影响35卷26期 8237 芪组、大黄组、甘草组、黄芩组凡纳滨虾血清蛋白含量最高 分别达到 419.0、396.6、407.8、356.4、363.5U/ml;而在投喂 5 种中草药后 7d和 14d,血清蛋白含量与投药前相比差异 极显著(P<0.01),但在试验后期除黄芪组与对照组之间差 异显著之外,各试验组与对照组之间无明显差异(P>0.05)。 2.6 攻毒试验结果(图5) 观察了7d内各组累积死亡率, 结果显示,注射鳗弧菌后 7d,对照组对虾的累积死亡率为 73.7%,鱼腥草组和黄芩组的累积死亡率分别为 93.7%和 73.7%,其中鱼腥草组的累积死亡率显著高于对照组,黄芩 组在整个试验过程中的累积死亡率均高于对照组,到 7d 累积死亡率与对照组相同;黄芪组、大黄组和甘草组在 3d 内累积死亡率略高于对照组,4d后累积死亡率达到稳定, 最终黄芪组和甘草组的累积死亡率为40%,大黄组的累积 死亡率为 46.7%均低于对照组。结果表明,投喂含黄芪、大 黄和甘草的饲料能显著地提高南美白对虾抵抗疾病的能 力,免疫保护率达到37%~46%。 3 讨论 试验结果表明,黄芪、大黄、甘草 3种中草药有利于凡 纳滨对虾生长,而鱼腥草则抑制其生长。究其原因可能是因 为黄芪、甘草和大黄含有黄芪多糖、甘草多糖、黄酮类化合 物、葡萄糖氨基酸等机体必需的营养成分,并已被证实有促 生长作用。郭文婷等给凡纳滨对虾投喂含有黄芪的复方中 草药饲料,生长明显增加[5]。王丽荣等给小鼠腹腔注射甘草 多糖,生长明显增加[6]。鱼腥草抑制凡纳滨对虾生长的原因 有待于进一步的研究。 对虾属无脊椎动物,且其体液不具有免疫球蛋白,但能 以其自身的防御机能抵抗病原体的袭击,如物理屏障、血细 胞的吞噬作用、溶菌酶和酚氧化酶、SOD酶等[7]。 酚氧化酶原激活系统(prophenoloxidase!activatedsystem, proPO!AS),由 PO、蛋白酶、模式识别蛋白和蛋白酶的抑制 剂构成。ProPO-AS能被微生物或寄生虫细胞壁中的 β!1,3 葡聚糖(C)、脂多糖(LPS)和肽聚糖(PG)等成分激活,将酚 氧化酶原转变为有活性的酚氧化酶释放到血淋巴中,将酚 氧化成醌,醌能自发形成最终产物黑色素(melanin)[8],黑色 素沉积到外来物上,通过包被和黑化将外来物限制和隔离, 而且黑色素及其代谢中间产物可抑制病原菌胞外蛋白质 和几丁质酶的活性,从而杀死微生物及寄生虫起到免疫作 用[9-11]。该研究表明,凡纳滨对虾的PO活力与投喂这5种中 草药有密切关系,在投药后 4~21d,PO活力与对照组相比 均有极显著的差异,说明这5种中草药能够有效地提高PO 活力。在投药后第14天各组的PO活力均达最大值,但在试 验后期(21~28d)各组 PO活力均有大幅度降低,这说明 5 种中草药不需要长期使用,尤其是鱼腥草不可以长期使用, 在后期出现抑制PO活力,具体的用药剂量和用药时间还有 待于进一步的研究。 溶菌酶是吞噬细胞杀菌的物质基础,体内有许多组织 和体液中都含有溶菌酶,血清溶菌酶主要来自血液中,是一 种碱性蛋白,能水解革兰氏阳性细菌的细胞壁中粘肽的乙酰 氨基多糖并使之裂解被释放出来,形成一个水解酶体系,破 坏和消除侵入体内的异物,从而担负起机体防御的功能[12-13]。 该研究表明,投喂黄芪、大黄和甘草这3种中草药可以显著 提高凡纳滨对虾的血清溶菌酶活力,在投药4d或7d后, 溶菌酶的活力与对照组之间有极显著差异。而黄芩组在整 个试验期间均保持在一个较低水平;鱼腥草组在投药后 14 d出现最低水平。溶菌酶活性与许多环境因子有关,如水 温。Grinde等研究报道在虹鳟、大西洋比目鱼和大菱鲆体内 血清溶菌酶活力与水温有密切关系[14];Tort等研究表明乌颊 鱼(Sparusaurata)的溶菌酶活力随着水温的降低而明显降 低[15];ALLangston等研究表明随着水温的增加溶菌酶活性 相应稳定的增加[16]。从图 2可以看出,投药后 21~28d溶菌 酶活性比试验前期要低很多,分析原因是因为试验后期天 气的变化,水温下降,这可能造成溶菌酶活力大幅度下降。 超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,简称 SOD),是 一类广泛存在于生物体内的金属酶,通过催化超氧阴离子 (O2-)发生歧化反应,产生过氧化氢(H2O2)和氧(O2),平衡体 内的氧自由基,是一种重要的抗氧化酶[17],在防止机体衰老 及生物分子损伤等方面具有极为重要的作用[18]。丁美丽等 研究发现超氧化物歧化酶活性与生物的免疫水平密切相 关[19]。该试验结果表明,投喂大黄、甘草和黄芩这3种中草药 可以提高凡纳滨对虾的血清SOD酶活力,在投药 7d或 14 d后,SOD酶活力与对照组相比差异极显著,且均在第14天 达到最高水平,这与A.I.Campa-Cordova[20]和刘恒[21]等用免疫 多糖如β!葡聚糖和硫酸聚多糖免疫南美白对虾可显著提高 其肌肉和血淋巴SOD酶的活性的结果相似,使虾体的免疫 力升高。而黄芪组在投药后血清 SOD酶低于对照组,且与 对照组差异显著。艾春香等[22]在饲料中添加 Vc饲养河蟹 后,发现血清和组织中的 SOD较对照组显著降低,认为是 由于Vc在河蟹体内能很好地发挥抗氧化作用,使自由基尚 未发挥作用前就被消除了,导致诱导性酶 SOD活性降低, 从而维持动物自身自由基的产生和消除的动态平衡。中草 药既可以抑制自由基的产生,又可直接消除自由基,还可以 安徽农业科学 2007年8238 增强机体本身抗氧化系统的功能,从多个环节阻断自由基 对机体的损伤作用[23]。所以添加黄芪饲喂凡纳滨对虾后可 以直接参与抑制和消除自由基,降低了 SOD的活性,起到 与Vc相类似的作用,而且从后面的攻毒试验结果发现黄芪 能够起到抵抗鳗弧菌的侵袭。 该试验结果表明,投喂这5种中草药后的7~14d,各组 血清蛋白含量与对照组相比差异显著。这可能是机体代谢 与合成系统受激活所致,体液反应的结果,合成了特异性的 多肽;或者是血清蛋白含量的升高使血清中溶菌物质、杀菌 物质等体液因子含量升高,从而提高虾的自身抵抗疾病的 能力[24]。第7d血清蛋白含量突然降低,分析原因可能是外 界环境温度突然变化所引起的。 攻毒试验结果表明,黄芪、大黄和甘草这3种中草药对 凡纳滨对虾抵抗鳗弧菌的能力有不同程度的提高,经过7d 的攻毒,免疫保护率达到 37%~46%;鱼腥草、黄芩反而降 低这种抵抗弧菌的能力,分析原因可能是鱼腥草和黄芩长 时间使用后,对凡纳滨对虾产生“免疫疲劳”的结果。Chang 等[25]认为在持续投喂免疫增强剂的情况下,对虾免疫指标 由上升至高峰再转为下降的这种现象,是由于长期投喂免疫 增强剂而导致的“免疫疲劳”的结果。所以在水质好、病原体 少的环境下,过度的提高免疫力可能导致用于促生长的能量 被消耗,从这一点考虑长期使用免疫增强剂并不可取[26]。这 也说明了长期使用鱼腥草、黄芩不仅不能提高对虾的免疫 能力,反而使其免疫能力受到抑制。 许多研究结果表明不同的复方中草药均可提高养殖动 物的非特异性免疫能力和抵抗疾病的能力[27-30],该试验也得 出相似的结论。从促生长、提高免疫力这两方面考虑,黄芪、 大黄和甘草是适合凡纳滨对虾的中草药免疫调节剂,且以 2%连续添加到第14天明显增强凡纳滨对虾的非特异性免 疫力。可见添加适合的免疫调节剂不仅有利于提高动物的 生长特性,还能提高对病原体的抵抗能力。 参考文献 [1]王吉桥,孙永新,张剑诚.金银花等复方中草药对牙鲆生长、消化和 免疫能力的影响[J].水产学报,2006,30(1):90-96. 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" !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!" ! ! ! ! ! ! ! ! ! " 著录用文字 (1)文后参考文献原则上要求用文献本身的文字著录。 (2)著录数字时,须保持文献原有形式,但卷期号、页码、出版年、版次等用阿拉伯数字表示。外文书的版次用序数词的缩写形式表示。 (3)个人著者,其姓全部著录,而名可以缩写为首字母;如用首字母无法识别该人名时,则用全名。 (4)出版项中附在出版地之后的省名、州名、国名等以及作为限定语的机关团体名称可按国际公认的方法缩写。 (5)西文期刊刊名的缩写可参照ISO4《信息与文献———出版物题名和标题缩写规则》的规定。 (6)著录外文文献时,大写字母的使用要符合文献本身文种的习惯用法。 GB/T7714-2005 8239