共表达O型口蹄疫病毒3C、P1-2A基因和猪白细胞介素18基因的重组鸡痘病毒免疫原性研究

书书书 中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（８）：２５～２８ 共表达 Ｏ型口蹄疫病毒３Ｃ、Ｐ１?２Ａ基因和猪白细胞 介素１８基因的重组鸡痘病毒免疫原性研究 刘慧娟１，２　金宁一２　马鸣潇１，２，３　金明兰１，２　沈国顺１，２ 霍晓伟１，２　鲁会军２　金扩世１，２　李　旭１，２　计　越１，２ （１中国人民解放军军事医学科学院军事兽医研究所　全军基因工程重点实验室　长春　１３００６２） （２吉林大学畜牧兽医学院　长春　１３００６２　３辽宁医学院畜牧兽医学院　辽宁　１２１００１） 摘要　目的：对筛选到的一株共表达Ｏ型口蹄疫病毒３Ｃ基因、Ｐ１?２Ａ基因和猪白细胞介素１８基 因的重组鸡痘病毒ｒＦＰＶ?３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ?１８进行免疫原性研究。：分别用重组鸡痘病毒 ｒＦＰＶ? ３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ?１８、ｒＦＰＶ?Ｐ１?２Ａ?３Ｃ和对照组２８２Ｅ４株 ＦＰＶ、ＰＢＳ对小鼠进行免疫接种，并检测各免 疫组的Ｔ淋巴细胞亚类数量、ＣＴＬ杀伤活性及抗体效价。结果：重组鸡痘病毒疫苗组免疫小鼠 Ｔ 淋巴细胞亚类数量，ＣＴＬ杀伤活性和抗体效价均显著高于对照组，且重组鸡痘病毒 ｒＦＰＶ?３Ｃ?Ｐ１? ２Ａ?ＩＬ?１８的小鼠Ｔ淋巴细胞亚类数量和ＣＴＬ特异性杀伤活性与ｒＦＰＶ?Ｐ１?２Ａ?３Ｃ相比，差异显著。 结论：为开发新型ＦＭＤＶ疫苗奠定了实验免疫基础。 关键词　口蹄疫病毒　重组鸡痘病毒　免疫原性 中图分类号　Ｑ９３９９１ 收稿日期：２００７０３２７　　修回日期：２００７０５２２ 国家“８６３”资助项目（２００１ＡＡ２１３０７１），吉林省科技发展计 划资助项目（２００４０２０２?１） 通讯作者，电子信箱：ｊｉｎｎｉｎｇｙｉ２０００＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ 　　口蹄疫（ＦＭＤ）是由口蹄疫病毒（ＦＭＤＶ）引起的偶蹄 动物的一种急性、烈性、高度接触性传染病。在世界范围 内广泛流行，给畜牧业带来灾难性损失，并极大地影响国 际贸易往来，使社会经济遭受惨重损失。目前ＦＭＤ的预 防疫苗主要是灭活疫苗，因其存在安全隐患：如疫苗生产 过程中由于不慎引起的病毒逃逸以及灭活不完全而导致 口蹄疫的爆发［１］等。因此，世界各国都非常重视研究更 加安全、有效、经济的新型ＦＭＤＶ疫苗。 　　本研究对本室已构建的重组鸡痘毒活载体疫苗 ｒＦＰＶ?３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ?１８和ｒＦＰＶ?Ｐ１?２Ａ?３Ｃ进行了小鼠免 疫试验研究，并对其Ｔ淋巴细胞亚类数量、ＣＴＬ杀伤活 性以及ＦＭＤＶ特异性抗体进行检测。 １　　材料与方法 １．１　实验材料 １．１．１　实验试剂　碱性磷酸酶标记兔抗鼠ＩｇＧ购自华 美生物工程公司；非放射性 ＣＴＬ杀伤活性检测试剂盒 购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＣＤ４＋、ＣＤ８＋标记单克隆抗体购自 北京医科大学；乳酸脱氢酶检测试剂盒为Ｐｒｏｍｅｇａ公司 产品。 １．１．２　细胞、实验动物　１８～２０ｇ的雌性 Ｂａｌｂ／ｃ小鼠 购自长春高新试验动物中心；ＨｅＬａ细胞和Ｐ８１５细胞为 本室保存。 １．１．３　毒株及 ＦＭＤＶ疫苗　重组鸡痘病毒 ｒＦＰＶ?Ｐ１? ２Ａ?３Ｃ［２］、ｒＦＰＶ?３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ?１８［３］由本实验室构建及保 存。鸡痘病毒２８２Ｅ４疫苗（ｗｔ?ＦＰＶ）购自中国兽医药品 监察所，ＴＣＩＤ５０为１×１０７／０．１ｍｌ。 １．２　实验方法 １．２．１　重组鸡痘毒疫苗株ｒＦＰＶ?３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ?１８的构 建　在Ｏ型口蹄疫病毒Ｐ１?２Ａ基因上游引入 Ｋｏｚａｋ序 列，下游通过 Ｌｉｎｋｅｒ与细胞因子 ＩＬ?１８联结，获得 Ｐ１? ２Ａ基因与猪ＩＬ?１８基因融合表达基因盒 Ｐ１?２Ａ?ＩＬ?１８， 将该表达基因盒 Ｐ１?２Ａ?ＩＬ?１８克隆至鸡痘病毒中间转 移载体ｐＵＴＡＬ?３Ｃ中，构建重组鸡痘病毒转移载体质粒 ｐＵＴＡＬ?３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ?１８（图１）。通过脂质体转染法，将 中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２７Ｎｏ．８２００７ 重组鸡痘病毒转移载体质粒ｐＵＴＡＬ?３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ?１８与 鸡痘病毒２８２Ｅ４株共转染鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ），通 过ＢｒｄＵ三次加压筛选，挑选出单克隆重组病毒株，最 后通过ＲＴ?ＰＣＲ、间接免疫荧光检测等方法进行鉴定。 成功获得了一株共表达Ｏ型口蹄疫病毒Ｐ１?２Ａ基因和 猪白细胞介素１８基因的重组鸡痘毒疫苗候选株 ｒＦＰＶ? ３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ?１８。 图１　重组鸡痘毒疫苗株ｒＦＰＶ?３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ?１８的构建 Ｆｉｇ．１　Ｓｃｈｅｍａｔｉｃｒｅｐｒｅｓｅｎｔａｔｉｏｎｏｆｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ｆｏｗｌｐｏｘｖｉｒｕｓｐｌａｓｍｉｄ １．２．２　重组病毒毒价测定　制备ＣＥＦ单层，至细胞长 至８０％融合时倾去培养液，用 Ｈａｎｋ’ｓ液洗两次，将用 于同源重组的 ＦＰＶ以 Ｈａｎｋ’ｓ液进行１０３～１０８稀释， 各取０．５ｍｌ接种于六孔板中，３７℃ ５％ＣＯ２培养箱中孵 育１～１．５ｈ后，补加ＭＥＭ完全培养液至３ｍｌ，继续培养 ７２～９６ｈ。吸去培养上清，补加含１％甲基纤维素和２％ 小牛血清（ＦＣＳ）的 ＭＥＭ作为维持液，３７℃ ５％ＣＯ２培 养箱中继续培养２４～４８ｈ。吸去培养液，用 ＰＢＳ洗两 次，室温下１％甲醛固定１５ｍｉｎ，自来水冲洗，０．１％结晶 紫染色５ｍｉｎ，自来水冲洗后在倒置显微镜下统计病毒 空斑数，用ＰＢＳ稀释成工作浓度５×１０７ＰＦＵ／ｍｌ待用。 １．２．３　免疫小鼠分组　２０只 Ｂａｌｂ／ｃ小鼠随机分成４ 组，每组５只，分别为：１组 ｒＦＰＶ?３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ１８，２组 ｒＦＰＶ?Ｐ１?２Ａ?３Ｃ，３组 ｗＦＰＶ对照，４组 ＰＢＳ对照。每只 小鼠均采用股四头肌注射，注射剂量如表１。每组动物 免疫３次，间隔１４ｄ。分别接种后，于０ｄ、１０ｄ、２１ｄ、２８ｄ 、３８ｄ对各组小鼠尾巴采血，分离血清，－２０℃保存待 检。最后一次免疫后１０ｄ，将小鼠摘眼球取血并拉颈处 死，进行免疫学指标检测。 １．２．４　小鼠免疫指标检测 　　Ｔ细胞亚类计数　取小鼠脾淋巴细胞悬液１×１０６／ ｍｌ～２×１０６／ｍｌ，分别加入荧光标记的 ＣＤ４＋及 ＣＤ８＋单 抗４５μｌ，室温避光反应３０ｍｉｎ，取出后用荧光洗液洗两 遍，加入０．５ｍｌ荧光保存液，以流式细胞仪计数１００００ 个细胞中的ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞个数为原始数据， 进行统计学。 表１　小鼠试验分组及免疫剂量 Ｔａｂｌｅ１　Ｖａｃｃｉｎｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓａｎｄｕｓａｇｅ ｆｏｒｍｉｃｅｉｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ Ｇｒｏｕｐ Ｎｕｍｂｅｒ Ｖａｃｃｉｎｅ ｄｏｓｅ １ ５ ｒＦＰＶ?３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ１８ ５×１０７ＰＦＵ ２ ５ ｒＦＰＶ?Ｐ１?２Ａ?３Ｃ ５×１０７ＰＦＵ ３ ５ ｗＦＰＶ ５×１０７ＰＦＵ ４ ５ ＰＢＳ ０．２ｍｌ 　　ＣｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ（ＣＴＬ）杀伤活性检测　在 ２４孔培养板中加入 １×１０７个／ｍｌ小鼠脾细胞悬液 ０．２５ｍｌ，同时加入 １ｍｌＲＰＭＩ１６４０培养液，置 ３７℃、５％ ＣＯ２条件下培养１～２ｄ，加入预先处理好的刺激细胞 （效应细胞与刺激细胞比例为１０∶１），共培养３～４ｄ，计 活细胞，调成 １×１０７／ｍｌ作为效应细胞备用。将用 Ｇ４１８筛选４次后表达目的基因的 Ｐ８１５细胞作为靶细 胞，用培养液调整细胞数至１×１０５／ｍｌ作为靶细胞。按 效应细胞和靶细胞５０∶１和２５∶１两个效靶比在９６孔培 养板中加入细胞，每孔液体总体积为２００μｌ，每个样本 设２个复孔，３７℃５％ ＣＯ２培养４～６ｈ，每孔吸取１００μｌ 上清，转入９６孔酶标板中，每孔加入新鲜配制的底物 液５０μｌ，室温避光反应３０ｍｉｎ后，每孔加５０μｌ终止液， 终止酶促反应。在酶标仪４９２ｎｍ处读取ＯＤ值，ＣＴＬ活 性用杀伤率表示，按如下公式计算： 杀伤率（％）＝实验孔－靶细胞对照孔－效应细胞对照孔靶细胞最大释放孔－靶细胞对照孔 　　采用间接ＥＬＩＳＡ方法检测ＦＭＤＶ特异性抗体的滴 度　用间接ＥＬＩＳＡ方法检测 ＦＭＤＶ抗体效价，主要参 照《动物病毒学》第二版进行［４］，具体操作如下：以纯化 的原核表达的Ｏ型ＶＰ１蛋白（２μｇ／孔）包被９６孔酶标 板；以１００μｌ／孔加入封闭液，于３７℃封闭１．５ｈ；加入一 抗（被检小鼠血清）于３７℃孵育１．５ｈ；用ＰＢＳ缓冲液洗 涤三次；加入辣根过氧化物酶标记的兔抗鼠 ＩｇＧ为二 抗，于３７℃孵育１．５ｈ；洗涤后于暗处放置１～３ｍｉｎ；待 显色后每孔加入５０μｌ３０％浓硫酸终止液；使用酶标仪 测定每孔的ＯＤ４９２值，以空白孔调零。 ２　结　果 ２．１　ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ淋巴细胞水平变化 　　流式细胞仪分析 Ｔ细胞亚群，所得数据进行统计 ６２ ２００７，２７（８）刘慧娟 等：共表达０型口蹄疫病毒３Ｃ、Ｐ１－２Ａ基因和猪白细胞介素１８基因的重组鸡痘…… 学处理（图２）。结果显示：重组鸡痘疫苗组 ｒＦＰＶ?３Ｃ? Ｐ１?２Ａ?ＩＬ１８、ｒＦＰＶ?Ｐ１?２Ａ?３Ｃ免疫小鼠的ＣＤ４＋、ＣＤ８＋Ｔ 淋巴细胞数均高于对照组ｗＦＰＶ及ＰＢＳ，且差异显著（ｐ ＜０．０１）；重组鸡痘疫苗组ｒＦＰＶ?３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ１８的Ｔ细 胞亚类数量与ｒＦＰＶ?Ｐ１?２Ａ?３Ｃ相比，差异较显著（ｐ＜ ０．０５）。表明ｒＦＰＶ?３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ１８免疫小鼠，能够有效 刺激机体Ｔ淋巴细胞数增高。 图２　各组免疫小鼠脾细胞中Ｔ细胞亚类数量 Ｆｉｇ．２　ＴｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆＴｓｕｂｓｅｔｃｅｌｌｓｉｎｓｐｌｅｅｎ ｃｅｌｌｓｏｆｉｍｍｕｎｉｚｅｄｍｉｃｅ ２．２　ＣｙｔｏｔｏｘｉｃＴｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓ（ＣＴＬ）杀伤活性检测 　　用乳酸脱氢酶法检测 ＣＴＬ杀伤率，并对其进行了 统计学分析（图３）。结果表明：重组鸡痘病毒ｒＦＰＶ?３Ｃ ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ１８、ｒＦＰＶ?Ｐ１?２Ａ?３Ｃ免疫小鼠的 ＣＴＬ杀伤率 均高于对照组，且差异极显著（ｐ＜０．０１）。重组鸡痘疫 苗ｒＦＰＶ?３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ１８的杀伤率也较 ｒＦＰＶ?Ｐ１?２Ａ?３Ｃ 组高（ｐ＜０．０５）。在效靶比 ２５∶１、５０∶１时有 ３５％ ～ ６０％的杀伤率，说明所构建的重组鸡痘疫苗能有效激 发机体的特异性细胞毒杀伤活性。 图３　免疫小鼠ＣＴＬ杀伤活性检测 Ｆｉｇ．３　ＴｈｅＯＤｖａｌｕｅｏｆＣＴＬａｓｓａｙｏｆｉｍｍｕｎｉｚｅｄｍｉｃｅ ２．３　ＥＬＩＳＡ抗体的动态变化 　　间接ＥＬＩＳＡ方法对 ＦＭＤＶ特异性抗体进行检测， 血清ＩｇＧ抗体水平变化如图（图４）。结果显示：重组鸡 痘病毒ｒＦＰＶ?３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ１８、ｒＦＰＶ?Ｐ１?２Ａ?３Ｃ组免疫的 小鼠抗体水平，均显著高于 ｗＦＰＶ及 ＰＢＳ对照组（ｐ＜ ０．０１）；重组鸡痘疫苗组ｒＦＰＶ?３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ１８免疫小鼠 的抗体水平比对照组ｒＦＰＶ?Ｐ１?２Ａ?３Ｃ略高。 图４　免疫小鼠ＥＬＥＳＡ抗体ＯＤ值的动态变化 Ｆｉｇ．４　ＯＤｖａｌｕｅｏｆＥＬＥＳＡａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔ Ｏ?ＦＭＤＶｏｆｉｍｍｕｎｉｚｅｄｍｉｃｅ ３　讨　论 　　ＦＭＤＶ为单股正链ＲＮＡ病毒，基因组全长约８５００ 个核苷酸（ｎｔ），编码一个大的多聚蛋白，其结构蛋白Ｐ１ 在自身裂解酶３Ｃ的作用下裂解，产生４种具有免疫原 性的结构蛋白 ＶＰ１、ＶＰ２、ＶＰ３和 ＶＰ４。与结构蛋白 Ｐ１ 相连的非结构蛋白２Ａ具有自身裂解作用，这就保证了 位于其两侧的蛋白各自独立发挥其生物学功能。目 前，２Ａ蛋白的该特性已被广泛应用于 ＨＩＶ和肿瘤等方 面的研究［５］。基于对 ＦＭＤＶ基因组结构的充分认识， 各国研究者将ＦＭＤＶ衣壳蛋白前体 Ｐ１基因和蛋白酶 ３Ｃ基因广泛地应用到 ＦＭＤＶ病毒活载体疫苗或核酸 疫苗的研究中［６，７］，同时为了提高 ＦＭＤＶ基因工程疫苗 的免疫原性，研究者又通过共接种或者共表达细胞因 子和趋化因子如ＩＬ?２、ＩＦＮ?α／β等免疫佐剂，或采用不 同的免疫策略来提高免疫效果。 　　本研究对本课题组已成功筛选到的两株共表达 ＦＭＤ保护性抗原基因和免疫辅助基因的非复制型重组 鸡痘病毒活载体疫苗ｒＦＰＶ?３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ１８和ｒＦＰＶ?Ｐ１? ２Ａ?３Ｃ进行了小鼠模型试验。结果显示，在所有实验组 中，两株重组鸡痘病毒组ｒＦＰＶ?３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ１８和ｒＦＰＶ? Ｐ１?２Ａ?３Ｃ的 Ｔ细胞亚类数量、ＣＴＬ杀伤率及 ＦＭＤＶ特 异性抗体滴度均有明显增高，且均显著高于两对照组 ｗＦＰＶ及ＰＢＳ；表明这两株重组鸡痘病毒均具有良好的 免疫原性。而两重组鸡痘病毒株相比，ｒＦＰＶ?３Ｃ?Ｐ１?２Ａ ?ＩＬ１８的Ｔ细胞亚类数量、ＣＴＬ杀伤率均比ｒＦＰＶ?Ｐ１?２Ａ ７２ 中国生物工程杂志 ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２７Ｎｏ．８２００７ ?３Ｃ有明显增高，ＦＭＤＶ特异性抗体滴度也较 ｒＦＰＶ?Ｐ１? ２Ａ?３Ｃ有一定程度的提高。这说明通过共表达细胞因 子ＩＬ１８作为免疫调节剂，不仅较显著地增强了 Ｔｈ１型 免疫反应，而且在 Ｔｈ２型免疫反应中也发挥了一定的 作用。由此可推测，连在 ＩＬ１８和 Ｐ１基因之间的２Ａ基 因在重组鸡痘病毒中也获得了表达，２Ａ基因的存在进 一步保证了 ＩＬ?１８和 Ｐ１各自独立发挥其生物学作用。 本实验为ＦＭＤＶ重组鸡痘病毒活载体疫苗在猪牛等本 体动物体内的免疫实验提供了较好的理论基础和试验 材料。 参考文献 　［１］ＢｅｃｋＥ，ＳｔｒｏｈｍａｉｅｒＫ．ＳｕｂｔｙｐｉｎｇｏｆＥｕｒｏｐｅａｎｆｏｏｔ?ａｎｄ?ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓｓｔｒａｉｎｓｂｙｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ． Ｖｉｒｏｌ，１９８７，６１（５）：１６２１～１６２９ 　［２］张洪勇，金宁一，葛淑敏，等．共表达 ＦＭＤＶＰ１?２Ａ和３Ｃ重 组鸡痘病毒疫苗与核酸疫苗的实验免疫研究．高新技术通 讯，２００４，８：２０～２３ ＺｈａｎｇＨＹ，ＪｉｎＮＹ，ＧｅＳＭ，ｅｔａｌ．ＨｉｇｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＬｅｔｔｅｒｓ， ２００４，８：２０～２３ 　［３］刘慧娟，金宁一，马鸣潇，等．共表达Ｏ型口蹄疫病毒 Ｐ１?２Ａ 基因和猪白细胞介素１８的重组鸡痘病毒的构建．中国生物 工程杂志，２００６，２６（９）：２０～２３ ＬｉｕＨＪ，ＪｉｎＮＹ，ＭａＭＸ，ｅｔａｌ．ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ．２００６， ２６（９）：２０～２３ 　［４］殷震，刘景华．动物病毒学．第 ２版 北京：科学出版社， １９９７．４２２～４２７ ＹｉｎＺＨ，ＬｉｕＪＨ．ＡｎｉｍａｌＶｉｒｏｌｏｇｙ．２ｎｄｅｄ．Ｂｅｉｊｉｎｇ：Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ，１９９７．４２２～４２７ 　［５］ＣｈｉｎｎａｓａｍｙＤ，ＭｉｌｓｏｍＭ Ｄ，ＳｈａｆｆｅｒＪ，ｅｔａｌ．Ｍｕｌｔｉｃｉｓｔｒｏｎｉｃ ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌｖｅｃｔｏｒｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅＦＭＤＶ ２Ａ ｃｌｅａｖａｇｅｆａｃｔｏｒ ｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｒｏｂｕｓｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｅｎｃｏｄｅｄｇｅｎｅｓａｔｌｉｍｉｔｉｎｇＭＯＩ． Ｖｉｒｏｌ，２００６，１５：３～１４ 　［６］ＭａｙｒＧＡ，Ｏ’Ｄｏｎｎｅｌｌ，ＣｈｉｎｓａｎｇａｒａｍＪ，ｅｔａｌ．Ｉｍｍｕｎｅｒｅｓｐｏｎｓｅｓ ａｎｄｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎａｇａｉｎｓｔｆｏｏｔ?ａｎｄ?ｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ（ＦＭＤＶ） ｃｈａｌｌｅｎｇｅ ｉｎ ｓｗｉｎｅ ｖａｃｃｉｎａｔｅｄ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ?ＦＭＤＶ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｓ．Ｖａｃｃｉｎｅ，２００１，１９（１５?１６）：２１５２～２１６２ 　［７］ＢｅａｒｄＣ，ＷａｒｄＧ，ＲｉｅｄｅｒＥ，ｅｔａｌ．ＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＤＮＡｖａｃｃｉｎｅｓ ｆｏｒｆｏｏｔ?ａｎｄ?ｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅ，ｅｖａｌｕａｔｉｏｎｏｆｖａｃｃｉｎｅｓｅｎｃｏｄｉｎｇ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇａｎｄ ｎｏｎ?ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄｓｉｎ ｓｗｉｎｅ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９９，７３（２?３）：２４３～２４９ ＩｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＦｏｗｌ?ｐｏｘＶａｃｃｉｎｅｓＣｏｅｘｐｒｅｓｓｉｎｇ Ｆｏｏｔ?ａｎｄ?ＭｏｕｔｈＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ３Ｃ、Ｐ１?２ＡＧｅｎｅａｎｄＰｏｒｃｉｎｅＩｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ１８ ＬＩＵＨｕｉ?ｊｕａｎ１，２　ＪＩＮＮｉｎｇ?ｙｉ２　ＭＡＭｉｎｇ?ｘｉａｏ１，２，３　ＪＩＮＭｉｎｇ?ｌａｎ１，２　 ＳＨＥＮＧｕｏｓｈｕｎ１，２　ＨＵＯＸｉａｏｗｅｉ１，２　ＬＵＨｕｉ?ｊｕｎ２　ＪＩＮＫｕｏ?ｓｈｉ２　ＬＩＸｕ１，２　ＪＩＹｕｅ１，２ （１ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅＪｉｎｌｉｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　１３００６２，Ｃｈｉｎａ） （２ＧｅｎｅｔｉｃＥｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＬａｂｏｒａｔｏｒｙ，ＡｃａｄｅｍｙｏｆＭｉｌｉｔａｒｙＭｅｄｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ　１３００６２，Ｃｈｉｎａ （３ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＶｅｔｅｒｉｎａｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＬｉａｏｎｉｎｇＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｊｉｎｚｈｏｕ　１２１００１，Ｃｈｉｎａ） 　　Ａｂｓｔｒａｃｔ　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：Ｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｏｆａｎｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｆｏｗｌ?ｐｏｘｖｉｒｕｓｒＦＰＶ?３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ?１８． Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＭｉｃｅｗｅｒｅｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＦＰＶ（ｒＦＰＶ）ｒＦＰＶ?３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ?１８，ｒＦＰＶ?Ｐ１?２Ａ?３Ｃ ｖａｃｃｉｎｅｓ，２８２Ｅ４ＦＰＶａｎｄＰＢＳｗａｓｓｅｔａｓｔｈｅｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｓ．ＴｈｅＦＭＤＶｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｔｉｂｏｄｙ，ｎｕｍｂｅｒｏｆＴｓｕｂｔｙｐｅ， ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｓｐｅｃｉａｌＣＴＬｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｏｔｈｅｒｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐｓ，ｔｈｅｍｉｃｅｉｎｏｃｕｌａｔｅｄｗｉｔｈ ｒＦＰＶ?３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ?１８，ｒＦＰＶ?Ｐ１?２Ａ?３Ｃｖａｃｃｉｎｅｓｗｅｒｅｉｎｄｕｃｅｄｈｉｇｈｅｒａｎｔｉ?ＦＭＤＶａｎｔｉｂｏｄｙｔｉｔｅｒ，ａｌａｒｇｅｒｎｕｍｂｅｒ ｏｆＴｓｕｂｔｙｐｅ，ａｎｄｈｉｇｈｅｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｓｐｅｃｉａｌＣＴＬ．ＣｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｒＦＰＶ?Ｐ１?２Ａ?３Ｃｖａｃｃｉｎｅ，ｒＦＰＶ?３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ ?１８ｃａｎｉｎｄｕｃｅｌａｒｇｅｒｎｕｍｂｅｒｏｆＴｓｕｂｔｙｐｅａｎｄｈｉｇｈｅｒｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｏｆｓｐｅｃｉａｌＣＴＬ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：Ｉｔｉｓｅｖｉｄｅｎｔｔｈａｔ ｔｈｅｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｆｏｗｌ?ｐｏｘｖｉｒｕｓｒＦＰＶ?３Ｃ?Ｐ１?２Ａ?ＩＬ?１８ｓｈｏｗｅｘｃｅｌｌｅｎｔｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙｉｎｍｉｃｅ，ｔｈｕｓｐｒｏｖｉｄｅ ｖａｌｕａｂｌｅｓｕｐｐｏｒｔｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆＦＭＤＶｇｅｎｅｔｉｃｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｖａｃｃｉｎｅｓ． Ｋｅｙｗｏｒｄｓ　ＦＭＤＶ　ＲｅｃｏｍｂｉｎａｎｔＦＰＶ（ｒＦＰＶ）　Ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ ８２