胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1在活化肝星状细胞中的表达及

胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1在活化肝星状细胞中的达及 毕业           作者：刘立新 张骞骞 郭晓红 赵嘉慧 韩德5  【摘要】  目的 研究胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(insulin?like growth factor binding protein?related protein?1，IGFBP?rP1)在转化生长因子β1(tronstorming growth factor β1,TGFβ1)诱导的肝星状细胞中表达的变化及抗IGFBP?rP1抗体对TGFβ1诱导的肝星状细胞产生Ⅰ型胶原的影响。 大鼠肝星状细胞株(HSC?T6)体外培养，分别设空白对照组(加入等量PBS)、不同浓度的TGFβ1处理组、不同浓度的抗IGFBP?rP1抗体处理组，处理因素作用24 h，采用免疫组织化学染色、Western blot检测IGFBP?rP1在HSC?T6中的表达，ELISA检测Ⅰ型胶原的含量并进行IGFBP?rP1与Ⅰ型胶原的相关性。结果 TGFβ1各处理组IGFBP?rP1的表达均较空白对照组显著增强。抗IGFBP?rP1抗体可以拮抗TGFβ1诱导的HSC?T6产生的过多Ⅰ型胶原。IGFBP?rP1与Ⅰ型胶原呈正相关(r=0.833，P<0.01)。结论 IGFBP?rP1参与了肝纤维化的形成，且可能在肝纤维化的发生、发展中占有重要地位。 【关键词】  胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1； 肝星状细胞； 转化生长因子β1； Ⅰ型胶原     【Abstract】  Objective  To study the expression of insulin?like growth factor binding protein?related protein?1 (IGFBP?rP1) in TGFβ1 induced hepatic stellate cell and the effects of anti?IGFBP?rP1 antibody on the collagen Ⅰ production of TGFβ1 induced hepatic stellate cell. Methods   Rat hepatic stellate cell line (HSC?T6) was cultured in vitro, and then was incubated with phosphate buffered solution (blank control group), TGFβ1  at 2 μg/L or 4 μg/L  (TGFβ1 group), anti?IGFBP?rP1 antibody at 0.1 μg/L, 1 μg/L or 2 μg/L (anti?IGFBP?rP1 antibody group) or both (TGFβ1+anti?IGFBP?rP1 antibody group). Twenty?four hours later, the expression of IGFBP?rP1 in HSC?T6 was detected by immunohistochemical staining and western blotting; the content of collagen Ⅰ in culture supernatant of HSC?T6 was measured by ELISA; the relationship between IGFBP?rP1 and collagen Ⅰ was analyzed. Results  The expression of IGFBP?rP1 in TGFβ1 group was significantly higher than that in blank control group. The result of ELISA showed that anti?IGFBP?rP1 antibody antagonized the over?production of collagen Ⅰ by TGFβ1 induced HSC?T6. There was a positive correlation between IGFBP?rP1 and collagen Ⅰ (r=0.833, P<0.01). Conclusions  IGFBP?rP1 may play an important role in the formation and development of liver fibrosis.     【Key words】  IGFBP?rP1;  Hepatic stellate cell;  TGFβ1;  Collagen Ⅰ     近年来对肝硬化的治疗仍未有突破性的进展，因此， 推断肝硬化的发病机制中可能还有其他未知因素的参与［1］。胰岛素样生长因子结合蛋白相关蛋白1(insulin?like growth factor binding protein?rela?ted protein?1，IGFBP?rP1)即IGFBP7(又名mac25)是1种具有生物活性的蛋白［2］。本实验旨在进1步明确IGFBP?rP1在肝硬化、肝纤维化发生及发展中的作用，为临床寻找肝硬化、肝纤维化新的治疗靶点提供理论依据。     1  材料与方法     1.1  细胞与主要试剂     大鼠肝星状细胞(hepatic stellate cell,HSC)株(HSC?T6)由美国Professor Friedman S.L.惠赠；转化生长因子β1(tronstorming growth factor β1,TGFβ1)为英国Peprotech公司产品；免疫组织化学染色及Western blot检测所用1抗IGFBP?rP1山羊抗人多克隆抗体，Western blot检测所用驴抗山羊2抗，内参照β?肌动蛋白均为美国Santa Cruz公司产品；免疫组织化学染色所用抗山羊2抗为免疫组化试剂盒(SP法)提供，与2氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒均购自福建迈新生物技术开发有限公司；牛血清白蛋白(BSA)为美国Roche公司产品；分子量标记(Protein Marker)为立陶宛MBI公司产品；PVDF膜为美国SABC公司产品；胞质?胞核蛋白抽提试剂盒购自北京普利莱技术有限公司； Ⅰ 型胶原的ELISA定量检测试剂盒为北京博奥森生物技术有限公司产品。     1.2  处理因素的分组及添加     吸弃旧HSC?T6培养液后换含0.3%胎牛血清的培养液进行培养，同时加入处理因素进行实验分组。分为空白对照组(加入等量PBS)、TGFβ1 2、4、8、16 μg/L组，处理细胞24 h(预实验中曾处理过6、12、24、36及48 h，其中以24 h时IGFBP?rP1表达变化最为显著)后收集细胞爬片；重复处理1次，提取细胞质蛋白，分别进行免疫组织化学染色及Western blot分析； 空白对照组、 TGFβ1 2、 4 μg/L组、抗IGFBP?rP1抗体0.1、 1、 2 g/L组及TGFβ1 2 μg/L+抗IGFBP?rP1抗体0.1 g/L、 TGFβ1 2 μg/L+抗IGFBP?rP1抗体1 g/L、TGFβ1 2 μg/L+抗IGFBP?rP1抗体2 g/L、TGFβ1 4 μg/L+抗IGFBP?rP1抗体0.1 g/L、TGFβ1 4 μg/L+抗IGFBP?rP1抗体1 g/L组，处理HSC?T6 24 h后收集细胞培养液上清进行ELISA检测。     1.3  免疫组织化学染色检测HSC?T6中IGFBP?rP1的表达     细胞爬片用1%多聚甲醛固定5 min，内源性过氧化物酶阻断剂孵育以灭活内源性过氧化物酶，PBS洗涤后，以正常非免疫动物血清封闭，之后以IGFBP?rP1抗体(1∶200)孵育过夜，经PBS洗涤，生物素标记的抗山羊IgG抗体孵育，经PBS洗涤，过氧化物酶标记的链霉素抗生物素孵育，经PBS洗涤，DAB显色。以PBS代替IGFBP?rP1抗体(1抗)作空白对照染色。图像分析系统进行图像半定量分析，采用每张切片随机选取5个视野(×200)，测定细胞中棕黄色和棕褐色阳性表达颗粒的累积光密度(interrated optical density,IOD)值。各组实验重复6次。1.4  Western blot分析IGFBP?rP1表达     将培养上清液去掉，PBS洗1遍，用0.25%胰蛋白酶消化HSC?T6，收集所有细胞后离心，向经离心后得到的100 μl细胞沉淀中加入500 μl细胞质裂解液裂解蛋白质。取30 μl总蛋白含量的裂解液进行15%102烷基硫酸钠?聚丙酰胺(SDS?PAGE)凝胶电泳。经PVDF膜转移。5%牛血清白蛋白TBST液(TBS＋0.1% Tween 20)封闭3 h，以IGFBP?rP1抗体(1∶500)孵育过夜，洗涤，再以辣根过氧化物酶偶联的第2抗体作用3 h，洗涤后DAB显色。以同1张蛋白印迹膜洗涤后，再以β?肌动蛋白孵育杂交，作为内参照。计算机图像扫描分析，测定灰度值(A)，经内参照β?肌动蛋白校正后得到蛋白的相对表达量。每个实验重复3批不同样本以上。     1.5  ELISA法检测HSC?T6培养液上清中Ⅰ型胶原的含量     收集细胞培养液上清为待测样本，检测步骤按试剂盒说明书进行。各组实验重复6次。     1.6  统计学分析     所有数据均以±s表示，采用SPSS 11.5统计软件进行ANOVA单因素方差分析，组间差异用SNK?q检验，相关性采用Pearson相关分析。P<0.05为差异有统计学意义。     2  结果     2.1  IGFBP?rP1在HSC?T6中的表达     各组细胞均可见胞质内棕黄色或棕褐色颗粒沉积，IGFBP?rP1呈阳性表达，但程度有所不同。空白对照组着色细胞数量少且颜色浅，而TGFβ1各处理组内大部分细胞胞质内呈棕黄甚或棕褐色着色，以TGFβ1 4 μg/L组阳性细胞数量最多且着色最深，见图1。Western blot分析见图2。     IGFBP?rP1 IOD值和A值在空白对照组呈低表达，实验各组较空白对照组增加，在TGFβ1 2、4 μg/L组中呈剂量依赖关系，但TGFβ1超过4 μg/L IGFBP?rP1反而下降(表1)。     2.2  HSC?T6中IGFBP?rP1与Ⅰ 型胶原的相关性分析     直线相关回归分析表明，IGFBP?rP1与Ⅰ型胶原呈正相关(r＝0.833，P<0.01)。Ⅰ型胶原的ELISA检查结果见表2。表1  IGFBP?rP1的累积光密度值和灰度值表2  Ⅰ型胶原的ELISA检测结果     3  讨论     近年来的研究发现，尽管导致肝纤维化的发病机制不同， 但肝纤维化最终是以激活的HSC产生过     多的细胞外基质沉积于肝脏形成肝纤维化为共同特征［3］。HSC是肝纤维化反应的重要效应器和细胞因子的主要来源及靶点［4］。TGFβ1是激活HSC并促进其表达细胞外基质的关键因子，TGFβ1与相应的特异性受体结合后，可激活HSC并促进HSC增殖和胶原的分泌。TGFβ1与肝纤维化程度关系最密切，是肝纤维化形成的主要细胞因子［5］。     Boers等［6］的研究表明，在肝脏中，激活的HSC可能是IGFBP?rP1的主要来源细胞；并且发现肝纤维化时激活的HSC向肌成纤维细胞转化过程中，IGFBP?rP1的基因在转化中期呈高表达。从而推测IGFBP?rP1可能是HSC活化的特异性标志，也许会成为肝纤维化发生的新的标志物。我们前期研究发现，肝纤维化患者肝组织IGFBP?rP1的表达较空白对照组明显增强，且随着病变程度的加重，其表达逐渐增强。经图像分析结果显示组间比较差异有统计学意义。IGFBP?rP1表达部位主要位于肝窦内和纤维间隔内的HSC、成纤维细胞及纤维间隔周围的肝细胞；且与肝组织TGFβ1、TGFRI、胶原纤维的表达呈正相关［7］。为了验证这1推测，我们进行HSC?T6体外培养，经不同剂量的TGFβ1处理后，采用免疫组织化学染色和Western blot分析后发现，IGFBP?rP1在空白对照组呈低表达，而TGFβ1的各个剂量组HSC?T6表达IGFBP?rP1的水平均较对照组显著增加，在1定范围内呈剂量依赖关系，其中以TGFβ1 4 μg/L组的作用最强。说明IGFBP?rP1能够在TGFβ1诱导的HSC活化中过高表达。但TGFβ1过高浓度剂量(>4 μg/L)组IGFBP?rP1的表达反而降低，推测可能是因为随着HSC?T6的不断活化，HSC自分泌TGFβ1逐渐增加，外源性TGFβ1刺激细胞表达IGFBP?rP1的增幅下降，完全活化的HSC?T6内源性TGFβ1较高，对外源性TGFβ1反应性下降所致。这也说明了肝纤维化过程中HSC与TGFβ1存在着相互制约、相互促进的关系。     HSC是细胞外基质的重要来源细胞［8］。TGFβ1刺激活化的HSC最明显的靶效应是诱导HSC大量合成Ⅰ型胶原等，阻断TGFβ1在HSC内的信号传导途径可抑制这种靶效应。我们选择以HSC?T6培养上清液中Ⅰ型胶原的检出量代表胶原的分泌量，观察到即使正常培养的HSC?T6(已有活化)，Ⅰ型胶原分泌量的背景值已较高，但TGFβ1仍可促进HSC?T6分泌Ⅰ型胶原，比未用TGFβ1 处理的HSC?T6分泌Ⅰ型胶原明显增多。同时，我们对经TGFβ1作用后IGFBP?rP1表达的增加与Ⅰ型胶原分泌量的增多进行了相关性分析，显示IGFBP?rP1的高表达与Ⅰ型胶原分泌量的增多呈正相关。抗IGFBP?rP1抗体对TGFβ1刺激的HSC?T6分泌Ⅰ型胶原有显著抑制作用， 其中以抗IGFBP?rP1抗体1 g/L作用于TGFβ1 4 μg/L最为显著。这表明抗IGFBP?rP1抗体可拮抗由TGFβ1诱导HSC过表达的Ⅰ型胶原，该抗体可以拮抗TGFβ1促肝纤维化的效应；也从另1方面说明IGFBP?rP1在肝纤维化形成过程中可能起着非常重要的作用。 【】   ［1］ Wynn TA. 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