Pit-1 siRNA对大鼠垂体生长激素腺瘤GH3细胞增殖和凋亡作用研究(可编辑)

Pit-1 siRNA对大鼠垂体生长激素腺瘤GH3细胞增殖和凋亡作用研究(可编辑) Pit-1 siRNA对大鼠垂体生长激素腺瘤GH3细胞增殖和 凋亡作用研究 徐州医学院 硕士学位 Pit--1 siRNA对大鼠垂体生长激素腺瘤GH3细胞增殖和凋亡的 作 用研究 姓名:李锦晓 申请学位级别:硕士 专业:外科学(神经外科) 指导教师:范月超 2012-05徐州医学院硕士学位论文 . 对大鼠垂体生长激素腺瘤细胞 增殖和凋亡的作用研究 中文摘要 目的 基因对大 研究垂体特异转录因子.. 鼠生长激素垂体腺瘤细胞增殖、凋亡的影响,为阐明腺瘤的发病 机制及 基因治疗提供理论和实验依据。 方法 将针对基因的 用 转染垂体腺 瘤细胞; .的沉默效率。 运用、蛋白免疫印迹等方法鉴定 实验分为沉默基因组转染. 和阴性对照组转染。 分别以流式细胞术和法检测沉默。对细胞凋亡、增殖能力的影 响。 结果与阴性对照组相比,转染目的小干扰基因的细胞基因的 及蛋白水平均显著降低.,干扰效果达%.%。 与阴性对照组相比,沉默.基因组的细胞凋亡率均明显增.。 与阴性对照组相比,沉默.基因组的细胞增殖率明显降低. 结论 沉默.基因达可以抑制垂体肿瘤细胞增殖,促进细胞凋 亡。 关键词垂体肿瘤:.;生长激素;;增殖;凋亡。 徐州医学院硕士学位论文 一 邱 , .. : . 一 .. , 血 . . . %. %, .. , ... ;;;. : ;; 徐州医学院硕士学位论文 缩略词表 缩略词 英文全称 中文全称 牛血清白蛋白 细胞增殖.毒性检测法 焦碳二乙酯 双蒸水 ’改良培养基二甲基亚砜 溴化乙锭电化学发光 胎牛血清 胍 ? . ?氨基末端激酶千道尔顿 聚丙烯酰胺凝胶电泳磷酸盐缓冲液逆转录一聚合酶链反应 十二烷基硫酸钠 三羟甲基氨基甲烷 免疫印迹徐州医学院硕士学位论文 ?埠?’ 日? 吾 人脑垂体腺瘤是颅内较常见的肿瘤,约占所有颅内肿瘤的%一%。除小的微腺瘤外, 大的腺瘤,特别是具有侵袭性的垂体腺瘤,手术效果不佳,术后复发率高达%以。生长 激素腺瘤是内分泌较活跃的一种侵袭性垂体腺瘤,生长激素的过度分泌被视为恶性的内 分泌疾病,因为它可能造成全身各系统的损害并危及生命。目前包括手术、放疗在内的治疗 效果并不理想,虽然手术可以明显改善患者的临床症状,但术后患者体内的内分泌生化指标 不令人满意、复发率高,因而很难达到生物学治愈。研究手术、放疗之外的侵袭性垂体腺瘤 基因无疑具有重要的临床和社会意义。 垂体腺瘤是起源于垂体前叶腺细胞的单克隆肿瘤,迄今为止,垂体肿瘤的发病机制仍不清 楚。近年来,随着细胞生物学、分子生物学、神经生物学的飞速发展和新技术的应用,从分 子水平揭示腺瘤的发生、发展、激素信号的传导机制,寻找有效的分子治疗策略正成为国 内外神经外科和内分泌科的研究热剧’】。 目前,国内外对垂体肿瘤发病机制的研究主要集中在两方面【:一是垂体肿瘤起源与异 常生理调节的关系;二是垂体肿瘤源于癌基因的激活或抑癌基因的丧失。 现在,越来越多的研究集中于后者,并且表明垂体肿瘤发病机制与细胞内信号传导机制异 常有关: 蛋白点突变,蛋白激酶与垂体腺瘤。新迸的研究发现,垂体肿瘤 的发生与发展与其内在的基因缺陷有关,在约%的垂体腺瘤中被证实在肿瘤细胞膜刺 激性调节蛋白亚单位 基因有点突变,后者被称为癌基因,该癌基因通常出 现在 基因和密码子上,癌基因的作用在于破坏生长激素释放激素受体.蛋 白.腺苷环化酶通路。 蛋白激酶可能介入垂体腺瘤激素分泌和细胞增生。与正常垂体组织相比, 垂体肿瘤组织内蛋白激酶活性明显增高,垂体合成的释放剂的效应至少部分通 过第二信使系统发挥作用【?。蛋白激酶被认为与肿瘤的侵袭性 有关,且在侵袭性垂体 徐州医学院硕士学位论文 肿瘤细胞基因上有突变存在【】。 蛋白与垂体肿瘤的侵袭性。有研究发现【,,在部分的侵袭性垂体肿瘤中检 测出有.原癌基因的点突变,突变的蛋白可抑制酶的活性,并可使蛋白产生 潜在的致瘤效应,从而促进细胞增生。 垂体特异性转录因子与侵袭性垂体肿瘤的生物学行为。目前研究认为 垂体细胞的分化的确与某些转录因子的表达密切相判:促肾上腺皮质激素上游转录结合元 素决定细胞的分化,类固醇原因子..的表达决定垂体促性腺激素细胞的分化; 细胞、细胞以及细胞的分化需要蛋白的参与【。 在对侵袭性垂体肿瘤的研究中,是新近引起关注的靶标之一,现在的研究发现, 在侵袭性垂体肿瘤中过度表达,其与生长激素肿瘤的细胞增殖、激素分泌、细胞侵袭等 生物学行为均关系密切。 垂体特异转录因子编码结构域 的蛋白,包含一个 特异性区域 ,和一个同源性区域, .,?基因在人类位于第号染色体,全长,由个外显子和个内含子组成 ‘。大鼠的蛋白有个氨基酸组成,包含端转录激活区和区。端转录激活 区负责.蛋白对靶基因的转录激活,区由特异区和同源区组成,负责与靶 基因的特异性结合。作为垂体特异性转录因子,与胚胎期垂体前叶的发育和生长激素 、基因的表达关系密切。由此可见,对腺垂体、、细胞的正常发 育及发挥正常的功能起重要的作手】。 在胚胎时期,蛋白的表达较高,成长后正常垂体中的蛋白弱表达,在垂体 的发育过程中起着至关重要的作用,在垂体腺瘤细胞的增生、分化过程中同样扮演重要角色 。 研究表明【,,垂体特异性转录因子.是重要的组织特异性转录因子,对生长激 素基因表达起重要的调控作用,不仅可以激活基因的表达,而且能够调控细胞生 存和增生所必须的其他相关基因,自然发生的侏儒小鼠中存在?基因的突变或缺失,失去 激活靶细胞转录的能力,和侏儒小鼠中,基因表达量极低,甚至测 不到, 气徐州医学院硕士学位论文 垂体前叶的、和细胞萎缩,在人垂体中,基因突变可导致侏儒、先 天性甲 状腺功能低下及分泌缺乏。基因能否作为靶基因,在对腺瘤的治 疗中寻求一种 新的路径,无疑具有重要的理论和临床意义。 基于目前的理论和国内外的研究现状,开展本项目的研究。 徐州医学院硕士学位论文 材料和方法 材料 .试剂 美国公司 氯仿 上海生物工程技术服务有限公司 异丙醇 上海生物工程技术服务有限公司 上海生物工程技术服务有限公司 无水乙醇 上海生物工程技术服务有限公司 溴化乙锭 美国公司 用灭菌配制成 /置棕色瓶中,。避光保存 试剂盒 日本公司,一?保存备用天根生化科技北京有限公司 天根生化科技北京有限公司 聚合酶 琼脂糖 上海中科开瑞生物芯片公司 无核酶管 美国公司 无核酶枪头 美国公司 引物 上海生物工程有限公司 上海吉玛公司 美国公司 细胞系 一培养基 美国 公司 .培养基 美国 公司 马血清 美国 公司 杭州四季青公司 胎牛血清 碧云天公司 胰酶徐州医学院硕士学位论文 转染试剂盒 美国公司 膜 发光试剂 光胶片 柯达公司 上海生工进口分装 . 上海生工进口分装 ?匝 上海生工进口分装 上海生工进口分装 上海生工进口分装 上海生工进口分装 上海生工进口分装 上海生工进口分装 公司 公司 公司 公司 公司蛋白染液 美国.公司 甲醇 国产分析纯 定影显影试剂盒 碧云天 流式细胞术凋亡试剂盒 美国公司 单克隆一抗:兔抗鼠 美国公司 生物素标记的二抗羊抗兔 美国&公司 蛋白浓度试剂盒 碧云天生物公司 一 日本同仁化学研究徐州医学院硕士学位论文 .仪器 超净台工作台. 公司 定量仪 德国公司 扩增仪 德国公司 低速离心机?一 安徽中科中佳科学仪器有限公司 低温台式离心机 德国公司 电子天平 上海舜宇恒平科学仪器公司 微量加样器 公司 电泳槽、电泳仪 美国.公司 超低温冰箱 海尔集团 电热恒温鼓风干燥箱 型 上海精宏实验设备有限公司 水平电泳槽 美国.公司 二氧化碳恒温培养箱 上海 公司 水平调速摇床 海门市麒麟科技仪器公司 流式细胞仪 美国 公司 分光光度计 德国公司 细胞破碎仪 宁波生物工程公司 凝胶成像仪 上海公司 倒置相差显微镜 上海长方光学仪器厂 荧光倒置显微镜 日本公司 ? 蛋白电泳及电转仪. 美国.公司 台式恒温振荡器. 上海跃进医疗器械厂 ... 电热恒温培养箱. 上海跃进医疗器械厂 电热恒温水槽. 上海跃进医疗器械厂 徐州医学院硕士学位论文 .主要试剂的配制: .. 电泳缓冲液 碱 硼酸 . ./ . 加去离子水至 室温保存 .. 培养液配制 培养基干粉 袋 . 双蒸水定容至 ,使其最终浓度均为 /,调值为.,微孔滤 膜抽滤,.分装保存。 .. .平衡液: . . . . . . 一 酚红. 去离子水定容至 ,高压消毒后备用 .. .: .%胰酶消化液 胰酶. 调至.,.滤膜过滤除菌 . .: . . 徐州医学院硕士学位论文 . . . 调节至.,去离子水定容至 ,高压消毒后备用 ..细胞裂解液 / . .// ./ .? / . ..电泳缓冲液 玩 . .. ..,去离子水定容至调节 ..电转缓冲液 , .. 嘣 . . ..,去离子水定容至 调节 .洗膜液 ’ . . . 调节至.,去离子水定容至徐州医学院硕士学位论文 .. 封闭液 :%脱脂奶粉 脱脂奶粉 ? 调至. ..分离胶、浓缩胶 分离胶% 浓缩胶 . . . ’ . .. . % . . % . . . . 双蒸水 % . . . . . . 总计 .. .%嘶. . .. 徐州医学院硕士学位论文 方法 .细胞培养 大鼠生长激素垂体腺瘤细胞购自美国公司。大鼠生长激素垂体 腺瘤细胞用含.%胎牛血清、%马血清的培养基,在?、%、相 对湿度%的培养箱中培养,细胞呈贴壁生长。待细胞长满瓶底后, 弃掉培养液, 用.%胰蛋白酶消化,. 分瓶传代培养,取对数生长期细胞用于实 验。 .检测.的沉默效果 的和合成:将基因序列交于上海吉玛公司,由其设计及合成 目 的小干扰及阴性对照小干扰序列如下: :’’ :’一’ :’?’ :’.’ :’一’ :’ .’:’一’。 :’ .实验分组 实验细胞分为:沉默.组转染. 、阴性对照组转染接 和空白对照组不转染任何物质,转染前 种细胞,六孔培养板每孔细胞个, 后细胞达%的融合后转染。 .转染 。转染前 脂质体与比例为“: ,检测时间点为转染后 将细胞接种于孔塑料培养板,每孔细胞约个。培养基为含%牛 后达到%的融合即可转染。 血清的培养基,不含抗生素,细胞在 每孔用量为为,脂质体?,各用培养基?稀释,室温 徐州医学院硕士学位论文 静置 ,将两者混匀室温静置孵育 ,然后直接将混合物加到孔板 中。 轻轻摇晃混匀,培养箱内培养 后换为含.%胎牛血清、%马血清的 培 养基继续培养,不同时间点收集细胞进行检测。 . 反应检测目的基因的表达 .. 后细胞的总 提取沉默组和阴性对照组转染 长满底壁约%的细胞,置于冰上,吸去培养液,直接加入 ,反复 吹打。将细胞裂解液转移至. 管中。室温静置 后,。, 离心, 离心。吸取上清液至另一管,加入. 氯仿,剧烈涡旋混匀 ,。、 ,室温静置. 离心。可见上层水相,中间有机相, 、 下层酚相。吸取水相?,转移至新管中,加入等体积异丙醇,混匀, 室温 。。、 静置 离心,吸去液体可见白色沉淀。加入%乙 、 。 醇 ,剧烈混匀。。、 离心。吸去液体,真空干燥 、 溶于无核酶水中,。促溶 。紫外分光光度计检测?含量/比值, 用无核酶水稀释. /。 徐州医学院硕士学位论文 .. 的合成 按表内剂量配制反转录反应混合液 山 ×盯 山.山.肛 .. 实验样品 山反应条件: ? ? ::、 爪循环 ? 三 ? .. 反应 反转录产物 上游引物 下游引物 .× 补至? 序列,幂.在线设计引物并圣检验, 扫检索 徐州医学院硕士学位论文 均有美虱公司合成。 引物, 上游引物:’丸气.’, 下游引物:’..’ 产物长度。 .物: ?匕游引物: .. , 下游引物:’.’, 扩增产物大、。 反应条件: ?? 如 ? 如 个循环 、人 ? ? ’ ? .反应条件: ? ? ? ? 》椭环 ? ? 徐州医学院硕士学位论文 .. 产物检测 \ 取琼脂糖. ×电泳缓冲液于 烧瓶中微波炉中火熔 解沸腾至液体清亮。待温度冷却至~?时,加入终浓度为. /的溴化乙锭 轻轻混匀后倒入己放置好胶梳和制胶模板的制胶槽。凝胶厚度一 般为 ~ 。 待凝胶彻底凝固后,拔除胶梳,将凝胶放入盛有电泳液的槽中加样孔朝向 负极端,使液面高出凝胶 。将扩增的产物加入加样孔中;打开电源, 调节电压至, ,约 左右,电泳完毕,关闭电源。紫外灯观察, 采用凝胶成像系统对电泳结果行图像扫描观察。 产物长度为 ,目的条带处出现明暗不同 ,产物长度为 的条带判定目的小干扰的沉默效果。 .. 产物半定量分析 以产物量作为衡量相应基因表达水平的半定量指标。将电泳凝胶置于凝 胶图像分析系统半定量分析,计算所得产物的积分光密度与各自内参照积分光密 度的比值来反映该基因的水平。 . 鉴定转染后目的蛋白的表达 ..提取细胞总蛋白 转染 后吸出培养基,用预冷的洗三遍,每孔加入 含蛋白酶抑 制剂的细胞裂解液,冰上裂解 ,后将细胞碎片和裂解液移到. 的离心管 中,、 离心,取上清转移到无菌管中,加蛋白染液测蛋 、 白浓度后分装到管中。保存,取“蛋白样品加入蛋白上样液后煮沸 ,上样。 ..制胶、电泳和转膜 、 电泳, 配制%分离胶和%浓缩胶,峙蛋白样品上样, 。膜在甲醇中浸泡 电泳结束后,将胶浸泡到预冷的电转液平衡 活化后转移至预冷的电转液中平衡 ,再置于电泳胶上,用剪刀修剪膜边缘,徐州医学院硕士学位论文 使其略大于胶的边缘,玻璃棒赶尽其间的气泡。将膜与胶夹在上下两层滤纸中间, 压紧固定后置于电转槽中,以 恒压转膜 。根据转膜情况判断 转印效果。 ..封闭和抗体孵育 转移结束后,用%脱脂奶粉封闭 ,洗膜次,每次 ,吸水纸吸 孵育过夜, 干后,放入一抗单克隆一抗:兔抗鼠,稀释为:稀释液中, 洗膜次,每次 ,吸水纸吸干后,加入对应二抗:。孵育 。 ..蛋白检测 化学发光胶片显影:于暗室中,将试剂盒中液、液等体积混合 ./,混匀后均匀滴于膜上,使之反应~。用滤纸轻轻蘸 去多余液体,然后移入射线胶片盒中,在预先裁减好的射线胶片上曝光,曝 光时间约为~。后进行显影,定影。 .流式细胞术检测细胞凋亡率 取对数生长期的垂体瘤细胞接种于孔培养板每孔约 个细胞, 后 后细胞生长达到%融合时,以脂质体与比例为 : 转染。 换液, 后行流式细胞术检测,过程如下:吸出原有培养基,清洗细胞后 胰酶消化一 。镜下观察细胞收缩变圆,然后加入完全培养基中和胰酶并吹 打细胞。将吹打好的细胞悬液加入流式细胞管以 离心后去上清, 、 加入?的重悬。再次以 离心后去上清,每管加入工作液吹打混匀,加入 染液避光孵育 ,再 的和? 次加入 工作液后快速送检。 . .实验检测细胞增殖率 细胞增殖毒性检测法检测细胞的增殖率取对数生长期的 细胞接种于孔培养板每孔 个细胞, 后细胞生长达到%融合时,以脂质体 与比例为.?:.包裹、转染细胞。分组情况如前。每组设三个复孔,在转徐州医学院硕士学位论文 染后不同时间点收集细胞,每孔加入 ,继续培养,酶标仪测定在处的吸 光度值。实验重复三次。 .实验数据处理 . 和 软件采集并处理分析,用 结果经 对相关数据进行统计分析,.有统计学意义。.法检测目的组和对照组 细胞吸光度值的比较及流式细胞术检测目的组和对照组细胞凋亡率采用单向方差 分析,.有统计学意义。 徐州医学院硕士学位论文 结 果 法与 法检测细胞中目的小干扰效果 、 与 ,以沉 构建三条..,分别为: 默的表达。与阴性对照组烈 、空白对照组相比,转染目的小干扰 基 、 因.. 与.. 组水平与蛋白表达量 均显著减少.,表明三条小干扰的效果均佳,见表、,图、。 表 各组细胞表达,% 相对含量 . .?. .?. ~ .?. . .. 蛋白相对含量.?. . .?. 木.?. . .?.奉 注:转染基因组’.. 。 , 流式细胞术检测细胞凋亡情况 通过流式细胞术检测细胞凋亡率结果显示,转染目的小干扰基因 组细胞凋亡 率较阴性对照组增加.,如表。在流式细胞散点图上,与阴性对照组相 比,转染组右下象限细胞比例增加明显图,结果提示下调目的基因表达后, 能促进细胞凋亡。 表各组细胞在不同时间点的凋亡率%,, 注:注:转染目的小干扰基因组.. ,。 徐州医学院硕士学位论文 法检测细胞增殖率 通过法检测细胞增殖率结果显示,转染目的小干扰基因组细胞组 值较阴性对照组降低.,图,即转染目的小干扰基因组细胞增殖率较阴性 对照组降低.,如表,结果提示下调目的基因表达后分裂期细胞减少, 有抑制胶质瘤细胞增殖的作用。 表各组细胞在不同时间点的增殖率%,士, 注:注:转染目的小干扰基因组奉., ,?。 徐州医学院硕士学位论文 论 讨 人脑垂体腺瘤是颅内较常见的肿瘤,约占所有颅内肿瘤的%.%左右。除 小的微腺瘤外,大的腺瘤,特别是具有侵袭性的垂体腺瘤,手术效果不佳,术后 复发率高达%以。生长激素腺瘤是内分泌症状较活跃的一种侵袭性垂 体腺瘤,生长激素的过度分泌被视为恶性的内分泌疾病,因为它可能造成全身各 系统的损害并危及生命。目前包括手术、放疗在内的治疗效果并不理想,虽然手 术可以明显改善患者的临床症状,但术后患者体内的内分泌生化指标不令人满意、 复发率高,因而很难达到生物学治愈。研究手术、放疗之外的侵袭性垂体腺瘤基 因无疑具有重要的临床和社会意义。 垂体腺瘤起源于垂体前叶腺细胞的单克隆肿瘤,迄今为止,垂体肿瘤的发病 机制仍不清楚。近年来,随着细胞生物学、分子生物学、神经生物学的飞速发展 和新技术的应用,从分子水平揭示腺瘤的发生、发展、激素信号的传导机制, 寻找有效的分子治疗策略正成为国内外神经外科和内分泌科对 腺瘤的研究热 点【?。 在对侵袭性垂体肿瘤的研究中,是新近引起关注的靶标之一,现在的研 究发现【捌,.在侵袭性垂体肿瘤中过度表达,其与生长激素肿瘤的细胞增殖、 激素分泌、细胞侵袭等生物学行为均关系密切。 垂体特异转录因子.编码结构域 的 ,?和一个同源 蛋白包含一个特异性区域. 性区域.,.,.基因在人类位于第号染色体,全长 ,由个外显子和个内含子组成。作为垂体特异性转录因子,与胚胎 期垂体前叶的发育和生长激素、泌乳素基因的表达关系密切,对腺 垂体、、细胞的正常发育及发挥正常的功能起到重要的作用【。研 究表明【.?,是重要的组织特异性转录因子,对基因表达起到重要的调徐州医学院硕士学位论文 控作用,不仅可以激活基因的表达,而且能够调控和增生所必须的其它相关 基因。 .发挥生物学功能的关键在于能够识别特异的基因顺序,并与之结合,从 而引起细胞内基因转录,促进垂体前叶细胞基因转录,其生物学活性是由它 特有的分子结构决定的,与.,.等核转录因子同属于一个蛋白族,以 ,,三大核转录因子的字头命名,即所谓蛋白族【】。 目前,研究基因作用的常用实验方法主要有反义寡核普酸和干扰技术。 本实验设计针对的,应用脂质体转染.的 进入腺瘤细胞,实现沉默特异性识别、结合的效应,减少细 胞内基因转录。 检验基因的沉默效果,验证 本实验首先通过、 基因在腺瘤中的作用,探索沉默的作用。结果显示 转染细胞较未转染组可检测到. 表达和蛋白的表达明显减少, 差异有统计学意义.。在垂体腺瘤细胞中三条小干扰的沉默效果均在 %~%左右。实验结果显示三条片段均能有效抑制细胞内 表达,实现其基因沉默效应,显著减少细胞中.蛋白、?的表达。 同时本实验采用.法检测细胞的增殖能力。增殖也就是细胞的分裂增生, 是细胞繁衍生存的方式。肿瘤细胞都具有很强的增殖能力,体现在细胞周期上便 是处于分裂期的细胞增多,而将癌基因沉默后,肿瘤细胞分裂减少,增殖能力下 降。本实验结果显示转染目的小干扰后细胞的增殖率明显低于对照组,差异 有统计学意义,提示沉默一基因,下调.的表达能够抑制细胞 的细胞增殖。 细胞凋亡又称细胞程序性死亡,是细胞在一定生理或病理条件下遵循自身的 程序,自己结束其生命的过程。这是一个主动的、高度有序的过程,并受到基因 的严格调控。许多癌症的发生的原因都是自身的基因无法调控细胞有效地凋亡, 导致细胞无限制生长引起的,而沉默癌基因后的重要特征就是能使癌细胞凋亡率徐州医学院硕士学位论文 干扰后, 增加盼 。本实验采用流式细胞技术发现,细胞受 细胞凋亡较阴性对照组增多,揭示.可能促进细胞的凋亡。 以上结果表明沉默后可以抑制生长激素垂体腺瘤细胞的生长增殖、 增加其凋亡。研究表明【’,基因启动子的活性受锌指蛋白和. 的协同 作用;.作用于生长激素释放激素受体和生长抑素受体,进而调 控细胞的增殖;在多种垂体激素缺陷而致侏儒的鼠和人类中,均发现缺少 基因的活性,说明不仅与腺瘤细胞的特异性分化有关,而且还对其分泌 功能起一定的作用。但本实验中沉默.基因后对细胞凋亡和 增殖的作用的具体机制尚待进一步研究。 以为靶点治疗垂体腺瘤,目前国内研究只停留在人垂体瘤细胞体外实验 的阶段,我们通过本实验证明,基因对体外细胞在细胞增殖、凋亡等方 面起重要作用,初步得出结论可以以为靶点治疗生长激素垂体腺瘤。可大鼠 体内抑制的效果怎么样呢是不是和体外的效果一致呢在人体内的 效果是不是和大鼠体内相同呢这些都需要进一步的深入实验研究、探索论证。 最终为腺瘤的治疗提供一条可靠的途径。徐州医学院硕士学位论文 结 论 .沉默基因后可促进大鼠生长激素垂体腺瘤细胞凋亡,抑制其增 殖。 ..基因在垂体腺瘤的增殖、凋亡中起重要作用。 徐州医学院硕士学位论文 论文图片 泌? 撇露阳渤 囤 罩. 《 《. 一. . 、‖ ‖ 萝 爹 / ? ? 图 ?检测一 转染细胞小时后各组细胞 的表达水平 一一表示阴性对照组与转染组 一、 、一一 :转染后细胞中表达水平。:转染后细胞中表达统计结果。 与阴性对照组比较,木.。 。 ,‖?徐州医学院硕士学位论文 矿’ 羹 岿/ 、 、 。灞懒麟鬻赣麓斓麟缪爹辩。罐鬻獭蝴鳓黼黼萨土 鼍恕专章互嚣一 薹.’ , 恭 二 ?、 爹 爹一 爹。 ? 一 ? ? ? 图 检测蛋白表达情况。 转染细胞小时后蛋白表达。 检测结果统计图。 一组转染后,一蛋白表达明显下降:与阴性对照比师.,。 徐州医学院硕士学位论文 囵 州 ?;.对 圈一?; 删 ~届 ?一.凸 一 玉 崩 ’: 嫩 : :图流式细胞术检测 转然后不同时间点测定细胞凋亡率变化。 流式细胞技术细胞凋亡率散点图。不同时间点流式细胞仪检测细 胞凋亡率,统 计分析图。 转染组细胞凋亡与阴性对照组相比明显增加,差异有统计学意义, 岬. 徐州医学院硕士学位论文 一 圈. 口一 一一’ 帅 :?? 图 一检测各组细胞在不同时间点的增殖率,统计分析图。阴性对 照: ;转染组:一、、; 转染组细胞增殖率与阴性对照组比冲.,差异有统计学意义。 徐州医学院硕士学位论文 参考文献 .,’ , 】 . ,:?.’ . ,,: 【】.. , ,】 . . ,,:. ., 】 ,:?. ., 【】 . :. ,,:. . , , , . 【】 ,:?.. ,】 . : , : .. , , . ? 【】 . ,,:. ,,? . 】 ,,:?. . ,【】 , . . 徐州医学院硕士学位论文 ,:?. ., 【】 ., .:?. / , 【 . / . . .,: . , 【】 , . .,: . 【 , , , ..,:. . , 【 , , . , . , : , 【 , . , : . ,,:. : 【】 , :?. ., ., ,, 【 】 , ? .,,:. , , , . 【 .,,:.. , ,【 ,,:. 徐州医学院硕士学位论文, .】 ?. . ,,: , . 】 , , 一 .:. , . .., ., 【】 ?. ., :, , , . 】一/: ., :.. , .【】.,:. , , ., 【】 . . ,, : 【】 . . ,, :. , , , . 【】一. , : ..,..,,. ? ., : 【】 , , ., ,, . : 【】 .. ,,: 徐州医学院硕士学位论文 【】 . . .. ,;:【】. : .,, : ?.【, . : . ,:. 【】 . : .,,: . 【】 只 , . . ,:. 【. , 仃 . , : . : 】 , , , . ,, . ,, :. 徐州医学院硕士学位论文 侵袭性垂体腺瘤的分子生物学研究进展 综 述 垂体腺瘤为来源于垂体前叶腺细胞的单克隆腺瘤,根据其生物学行为分为非侵 袭性与侵袭性。侵袭性垂体腺瘤生物学行为介于恶性与良性腺瘤之间,它可破坏鞍 区骨质,侵袭海绵窦等鞍区结构,其高复发率、低治愈率以及术后并发症等给临床治 疗带来很大的困难【?,本文就侵袭性垂体腺瘤的分子生物学研究进展作一综述。 一、原癌基因 原癌基因是一类很保守的、普遍存在于生物界的基因,对人体正常生长发育起调节 作用。当原癌基因通过点突变等方式转变为活性癌基因时即有致癌作用,这种功能 突变是显性的,在肿瘤中能够得到表现型表达。 ..垂体腺瘤转化基因基因是应用差异显示技术从小鼠垂体腺 瘤分离并成功克隆的一个原癌基因,位于,编码的蛋白质含个氨基酸。 等团认为在肿瘤形成、浸润、转移、血管形成以及抗凋亡等方面其重要作 用,推测可通过影响成纤维细胞因子 ,、血 管内皮生长因子 ,、血管内皮生长因子受 体、分化抑制因子等途径或直接促进肿瘤血管形成;通过影响抑 癌基因促进肿瘤细胞的生长和转移。与细胞增殖指数在垂体腺瘤 中的表达与侵袭性及复发相关【。的高表达是肿瘤侵袭性行为的分子标志 【】 ..基因、基因:原癌基因编码与蛋白结构相关的蛋 白,蛋白具有葡萄糖转移酶活性,基因密码子、、上的突变可使基因 转化为活化癌基因。恶性肿瘤发生和基因点突变的联系已经得到证实,例如 结肠癌、甲状腺癌等。而目前垂体腺瘤中除了泌乳素腺瘤有相关报道外,还没有其 他类型垂体腺瘤中基因点突变发现的报道【。.基因编码丝氨酸/苏氨酸徐州医学院硕士学位论文 激酶。基因突变在其他恶性肿瘤中常见,而在垂体腺瘤中则是小概率事件‘。但 ?基因在无功能垂体腺瘤中呈过度表达,过度表达的.可能通过激活 .信号途径,引起/信号传导紊乱,导致细胞过度增殖,出现 恶性转化,从而导致无功能腺瘤的生长和侵袭有关【 ..基因:?基因位于,编码结合蛋白,后者在复制 的启动以及控制细胞增殖中有重要作用,研究发现垂体腺瘤中有.基因的表 达,而且表达量随着垂体腺瘤侵袭性程度的增高而增高。范月超等【】利用小 室侵袭模型,在体外检测垂体腺瘤细胞的侵袭能力,结果显示在体外培养的垂体腺 瘤细胞中,当?抗体与结合后,细胞侵袭力明显减弱,因此认为? 与肿瘤细胞的侵袭行为密切相关,抑制其表达,有助于阻止垂体腺瘤细胞的侵袭性 生长。 ..肝素结合分泌转化基因 基因:位于 ,编码成纤维生长因子 , .,是一种由个氨基酸组成的蛋白质,能促进细胞有丝分裂。正常 仅表达于胚胎组织,但在许多人类恶性肿瘤却有表达。等嘲对例垂体泌乳 素腺瘤研究表明:侵袭性垂体腺瘤中的表达水平显著高于非侵袭 性者。基 因可能通过其产物促进垂体瘤的侵袭生长。但在泌乳素腺瘤以外其他类型 的垂体腺瘤中没有类似表现。 二、抑癌基因 . .基因:目前发现基因分为抑癌基因和癌基因。抑癌基因产 生野生型蛋白,而癌基因产生突变型蛋白。正常野生型基因是 一种抗癌基因,将生长的细胞阻滞在期,在抑制细胞恶性转化等方面具有重要作 用。目前临床上检测到均为突变型。研究发现不同的突变型或野生型,导致不 同的侵袭潜力,突变型所占比例越多,肿瘤侵袭能力越强【】。等四研究发现 垂体癌中存在突变并伴有蛋白的高表达。等【采用免疫组化法研究 了例垂体腺瘤和例垂体腺癌,结果显示:在侵袭性垂体腺瘤中显著增高。侵袭徐州医学院硕士学位论文 性垂体腺瘤和垂体腺癌中基因异常表达的细胞比例高于非侵袭性腺瘤;与免 疫组化阴性肿瘤比较,阳性的肿瘤生长活性也明显升高。蛋白抑制肿瘤 生长效应的缺乏,可使肿瘤呈进展性生长,提示基因异常表达是侵袭性垂体腺瘤 的生物学标志,与垂体腺瘤侵袭性相关。 ..视网膜母细胞瘤易感基因 . , 基因:基因编码的蛋白在.期处于去低磷酸化状态,具抑 癌活性。当细胞接受生长信号等刺激后,高度磷酸化而丧失结合延长因子 ,的能力,释放出游离的,启动与增殖相关的基因群。据 等四研究发现,所有垂体腺癌和.%的侵袭性垂体腺瘤中有等位基因的 ,而非侵袭性垂体腺瘤无基因的。因此,基因的可能在良性垂 体腺瘤向恶性垂体腺瘤转变中发挥重要作用。而等的研究【】表明基因 的点突变常发生,,和,并且蛋白位点杂合性的表达水 平对早期评估垂体腺瘤侵袭性和生物学特征有重要的意义。 , ..基因:多发性内分泌腺瘤型.是一种常染色体显性遗传综合征,其特征为甲状旁腺、垂体前叶、胰岛及 少数类癌、甲状腺和肾上腺皮质同时发生高功能状态或肿瘤形成。基因定 位于。研究表明区的染色体等位缺失会导致相关的或偶发的 垂体腺瘤。等‘发现基因区域的等位基因缺失与促甲状腺激素腺 瘤 的侵袭性生长有关。 ..基因:基因是等于年从鼠黑色素瘤细胞的 文库筛选出来的第个肿瘤转移抑制基因。减少,一方面可能使微管聚合异常 而引起减数分裂时纺锤体异常,导致肿瘤细胞染色体非整倍数的形成,进而促进肿 瘤发展。另一方面可能通过影响细胞骨架而引起细胞运动从而参与侵袭转移和发 展过程。 等【研究发现皿的亚型表达水平与垂体腺瘤的侵袭性密切相关。并 提示.低表达对侵袭性垂体腺瘤术后复发倾向具有重要价值。 表 徐州医学院硕士学位论文 达缺失或低表达的原因可能是由于基因缺失,使得调节诱导产生.蛋 白表达量下降所致。..同源磷酸争张力蛋白基因 .:位于人染色体,其所编码的蛋白质是一种 磷酸酶,是近年来发现的具有双重特异性磷酸酶活性的抑癌基因。通过抑制 磷脂酰肌醇.激酶信号途径,抑制肿瘤生长与转移。在非侵袭性垂体腺瘤组 织的表达较高,其表达阳性率与正常脑组织无明显差异;侵袭性垂体腺瘤中 蛋白阳性率与正常脑组织比较有显著性差异,侵袭性垂体腺瘤与非侵袭性垂体瘤中 蛋白表达率相比较也有显著性差异【。在肿瘤中的失活与缺失,导致局 部肿瘤粘着斑激酶活性的上调,进而对细胞的迁移抑制减少,肿瘤的侵袭性增加。 ..基因:是细胞周期调节蛋白之一,又称为有丝分裂抑制因子或多 肿瘤抑制基因是或的特异性抑制剂,主要作用是与竞 争性结合或,抑制活性及基因蛋白产物磷酸化,阻止细胞从 期至期的过程,从而对有丝分裂进行负反馈调节,阻止细胞异常增殖。 在%无功能腺瘤%生长激素腺瘤%泌乳 等【研究发现 素腺瘤%促肾上腺皮质激素腺瘤中未检测到约%大腺瘤和%微腺瘤 为阴性,但是它们之间不具有统计学意义。认为 的表达异常与肿瘤类型更有关。 三、肿瘤增殖动力学 垂体腺瘤生长速度与肿瘤侵袭性的相关性已有许多研究报道,许多细胞周期特异 性核抗原逐渐为人们所认识,近来研究较多的是增殖细胞核抗原及 .核抗 原。..增殖细胞核抗原:增殖细胞核抗原 , ,又称周期素,为聚合酶的辅助蛋白,其表达水平与细胞增殖有 关。在正常细胞存在少量表达,在肿瘤细胞表达明显增加。因此,是评 价细胞增殖活性的良好指标。研究发现复发性垂体腺瘤的标记指数比非复 徐州医学院硕士学位论文 发性腺瘤的明显增高;同一患者再次手术比第次显著增高,因此标记指数 与侵袭性有关,有助于估计预后【】。等认为与垂体腺瘤的侵袭性 发挥协同作用, 和术后复发密切相关。它在垂体腺瘤进展过程中与, 促进细胞恶性增殖,加速恶性进程。 .. 抗原. .抗原是细胞增殖周期特异性核抗原,是细胞增殖活性 的标志。 .表达指数可以作为判断肿瘤生长速度的指标。应用.抗体识 别飚.抗原,发现侵袭性垂体腺瘤.指数高于非侵袭性垂体腺瘤;有海绵窦 侵袭者高于无海绵窦侵袭者;.表达指数%可作为区分侵袭性与非 侵袭性的 阈值,表达指数%,垂体腺瘤几乎均为侵袭性‘。等发现侵袭性垂体 腺瘤鼬.指数高于非侵袭性垂体腺瘤;在经过手术或药物治疗的侵袭性垂体腺瘤 瞄.指数明显低于未经过任何治疗的垂体腺瘤,因此认为.指数可以作为判断 垂体腺瘤侵袭性以及预后的指标。 四、其他相关基因与蛋白分子 ..与细胞凋亡是指为维持内环境稳定,由基因控制的细胞自主的 程序性死亡。当这种程序性调控出现异常,可促进或参与肿瘤的发生、发展。凋亡 是多基因严格控制的过程,在凋亡的线粒体途径中,.家族起着非常重要的调 控作用,其作用是双向的,.表现出抗凋亡的效应,而则有促凋亡作用 】。而黄垂学等】研究提示.在侵袭性垂体腺瘤中表达水平显著增高,而 的表达差异无显著性,提示垂体腺瘤侵袭性生长主要是由于.的抗凋亡 效应的增强,并非的促凋亡效应减弱的结果。..凋亡抑制 基因是新近发现的一种凋亡抑制基因,与效应细胞 蛋白酶受体 具有广泛基因同源性。呈周期依赖性表达,尤其在细胞周期 .期高表达,能直接抑制细胞凋亡下游终端效应器和可能 通过这一机制直接参与肿瘤的形成和发展。基因只在胚胎和肿瘤组织中表达,在终 末分化的成熟组织中不表达,在良性肿瘤表达很低而在恶性肿瘤中表达明显增 高,等【】通过检测例侵袭性垂体腺瘤组织和例非侵袭性垂体腺瘤组织