灵芝多糖拮抗前列腺素E2对小鼠脾细胞IFN-γ和TNF-α mRNA表达的抑制作用

灵芝多糖拮抗前列腺素E2对小鼠脾细胞IFN-γ和TNF-α mRNA表达的抑制作用 灵芝多糖拮抗前列腺素E2对小鼠脾细胞IFN-γ和TNF-α mRNA表达的抑制作用 摘要:目的 观察灵芝多糖拮抗前列腺素E2(PGE2)对小鼠脾细胞干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA表达的抑制作用。方法 混合淋巴细胞培养反应作为实验模型，半定量RT-PCR方法IFN-γ和TNF-α mRNA的表达水平。 结果 PGE2连续作用4 h后，脾细胞IFN-γ mRNA的表达与对照组比较受到不同程度的抑制，当PGE2浓度在10 μmol/L以上时具有统计学意义(P<0.01)。固定PGE2浓度为20 μmol/L，合用不同浓度的灵芝多糖，当灵芝多糖为100 mg/L以上时可部分对抗PGE2的抑制作用。培养8 h后，PGE2明显抑制TNF-α mRNA的表达，灵芝多糖为100 mg/L以上时可部分对抗。结论 灵芝多糖可部分拮抗PGE2对小鼠脾细胞IFN-γ和TNF-α mRNA表达的抑制作用。 关键词:灵芝多糖;前列腺素E2;干扰素γ;肿瘤坏死因子α;mRNA 灵芝[Ganoderma lucidum (Leyss ex Fr. Karst.)]是灵芝菌科灵芝属真菌。化学表明灵芝含有多种生物活性成分，如多糖类、核苷类、多肽类、三萜类等。其中，多糖是灵芝中主要的生物活性成分之一。研究报道，灵芝多糖具有增强免疫功能和抗肿瘤作用[1][2][3]，但其抗肿瘤作用的机制却不十分清楚。肿瘤逃避免疫监视的机制比较复杂，其中之一是有些肿瘤细胞能分泌前列腺素E2(PGE2)[4][5]，后者对免疫系统产生广泛的抑制作用，肿瘤得以逃避免疫系统的攻击，在体内无限生长。本研究的目的是观察灵芝多糖能否拮抗PGE 2对小鼠脾细胞干扰素γ(IFN-γ)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)mRNA表达的抑制作用，探讨灵芝多糖在免疫方面的抗肿瘤机理。 1 材料和方法 1.1 材料 1.1.1 动物 C57BL/6j(批号:2004A065)及BALB/c(批号:2004A066)小鼠(SPF级)，8至10周龄，雌雄兼用，购自南方医科大学实验动物中心。 1.1.2 药品与试剂 RPMI 1640培养基(GIBCO公司产品)，新生牛血清(杭州四季青生物材料有限公司产品)，HEPES(MDBio，分装)。DEPC、PGE2均为Sigma产品。RNAoutTM(深圳市华氏生物技术有限公司产品)。傻瓜RT反应体系(AccuPower RT PreMix，内含逆转录酶、dNTPs、RNA酶抑制剂、缓冲剂等)，傻瓜PCR反应体系(PCR PreMix，内含Tag DNA聚合酶、dNTPs、PCR增强剂、缓冲剂、上样染料及稳定剂)，均购自赛百盛公司。oligo d(T)18(TaKaRa产品)，琼脂糖(Biowest Agarose，上海YITO生物器材企业有限公司分销)，溴化乙锭(EB，上海博彩生物工程公司产品)。灵芝多糖参照文献[6]方法提取，为多糖组分，呈浅棕色，易溶于水，相对分子质量7000,9000。其余化学试剂均为分析纯。 1.1.3 仪器 CO2培养箱(美国Forma Scientific公司)，AB-120型电子分析天平(美国Denver Instrument公司)，台式低温高速离心机(Bechman公司)，PCR循环仪(PTC-100TM，美国MJ Research Inc.公司)，电泳仪(Power PAL3000，Bio-RAD公司)，凝胶成像分析系统(摄像暗箱:TFP-M/ML;分析软件:Bio-CAPT v.97;法国Ets VILBER LOURMAT公司)。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养 以混合淋巴细胞培养反应作为实验模型，具体操作参照文献[7]。无菌分离C57BL/6j及BALB/c小鼠脾细胞，1?1混合，用含10%新生牛血清的RPMI 1640培养基接种于96孔板中，细胞密度为每孔8×105个，另加实验药品，总体积为200 μl。于37 ?、含5%CO2饱和水蒸气的孵箱中根据实验不同培养所需的时间，检测IFN-γ mRNA表达时为4 h，检测TNF-α mRNA表达时为8 h。 1.2.2 实验 为了确定合适的PGE2浓度作为抑制模型，首先研究PGE2抑制IFN- γ mRNA表达的量效关系。设4个PGE2浓度组，分别为5、10、20、40 μmol/L，对照组加等体积的培养液，得半效抑制浓度约为20 μmol/L。然后固定PGE2浓度为20 μmol/L，在其中再加入不同浓度的灵芝多糖(100、200 mg/L)，观察灵芝多糖拮抗PGE2对IFN-γ或TNF-α mRNA表达的抑制作用，共设5组，即:空白对照组(加等体积培养液)，灵芝多糖(200 mg/L)促进表达组，PGE2(20 μmol/L)抑制表达组，PGE2(20 μmol/L)+灵芝多糖(100 mg/L)组，PGE2(20 μmol)+灵芝多糖(200 mg/L)组。 1.2.3 总RNA提取 根据厂家说明书所提供的方案按比例缩小进行操作。细胞在培养4 h(检测IFN-γ mRNA)或8 h(检测TNF-α mRNA)后，先吸弃96孔板中的培养液，然后，每孔加RNAoutTM试剂40 μl，每组收集10孔裂解液于1 ml Eppendorf管中，提取总RNA。 1.2.4 逆转录反应 先将DEPC处理水配制的oligo dT18(10 nmol/L)与DEPC处理水配制的总RNA(0.1 mg/L)按体积比1?1混合于Eppendorf管中，70 ?孵育5 min，4 ?冷却2 min。吸取上述混合液20 μl加入AccuPower RT PreMix管中，振荡混匀，快速离心数秒，置PCR循环仪中反应。反应参数如下:42 ?逆转录反应60 min，然后94 ?终止反应5 min。 1.2.5 PCR扩增 PCR引物采用在线软件Primer3进行设计。小鼠IFN-γ上游引物:5'-ttt gag gtc aac aac cca ca-3'，下游引物:5'-cgcaat cac agt ctt ggc ta-3'，PCR扩增产物为388 bp。小鼠TNF-α上游引物:5'-agt ccg ggc agg tct act tt-3'，下游引物:5'-gca cct cag gga aga gtc tg-3'，PCR扩增产物为422 bp。小鼠β-actin上游引物:5'-cca gag caa gag agg tat cc-3'，下游引物:5'-ggg gtg ttg aag gtc tca aa-3'，PCR扩增产物为216 bp。 PCR操作如下:在PCR PreMix 管中加入消毒双蒸水8 μl，被检测基因mRNA逆转录产物或内参β-actin mRNA逆转录产物2 μl，相应的上、下游引物各5μl(15 pmol)，振荡混匀，加石蜡油15 μl，快速离心数秒， 置PCR循环仪中反应。反应参数如下: 94 ?预变性2.5 min，然后进入以下28个循环:94 ?变性45 s，57 ?退火1 min，72 ?延伸1.5 min。循环完毕，72 ?延伸5 min。 1.2.6 半定量分析 取被检测基因和β-actin RT-PCR扩增产物上样于2%琼脂糖凝胶(含EB 0.05%)梳孔中，采用0.5×TBE电泳缓冲液，在3 v/cm电压条件下电泳50 min。将凝胶转移至凝胶分析系统暗箱中，在紫外线照射下测定PCR扩增产物的荧光强度值。结果表示为:(被检测基因扩增产物荧光强度值?相应β-actin扩增产物荧光强度值)×100%。 1.3 统计学处理 组间显著性差异采用配对资料的t检验。 2 结果 2.1 PGE2对混合淋巴细胞培养反应(MLR)中IFN-γ mRNA表达的抑制作用 不同浓度PGE2连续作用4 h后，MLR中小鼠脾细胞IFN-γ mRNA表达受到不同程度的抑制，随着PGE2浓度的增加，抑制作用不断增强。PGE2浓度在10 μmol/L以上时与空白对照组比较，其抑制作用具有统计学意义(P<0.01，n=5，图1)，半效抑制浓度约为20 μmol/L。因此，选择20 μmol/L的PGE2作为抑制模型的造模浓度。 2.2 灵芝多糖拮抗PGE2对MLR中脾细胞IFN-γ mRNA表达的抑制作用 在MLR中，固定PGE2浓度为20 μmol/L，在其中再加入不同浓度的灵芝多糖(100或200 mg/L)，观察灵芝多糖对PGE2的拮抗作用。培养4 h后，灵芝多糖(200 mg/L)明显促进小鼠脾细胞IFN-γ mRNA的表达，而PGE2(20 μmol/L)呈明显的抑制作用(P<0.01，n=5)。当灵芝多糖为100和 200 mg/L时可部分对抗PGE2(20 μmol/L)对IFN-γ mRNA表达的抑制作用(P<0.05，P<0.01，n=5，图2)。 图1 PGE2对小鼠混合淋巴细胞培养反应中脾细胞IFN-γ mRNA表达的抑制作用 Fig.1 PGE2 inhibits murine splenocyte IFN-γ mRNA expression in mixed lymphocyte culture reaction (MLR) 1: Control; 2: PGE2 (5 μmol/L); 3: PGE2 (10 μmol/L); 4: PGE2 (20 μmol/L); 5: PGE2 (40 μmol/L); **P<0.01 vs control; A: A representative gel electrophoretogram of 5 experiments. B: Percentages of IFN-γ mRNA PCR product relative to that of β-actin by digital gel image analysis. 图2 灵芝多糖拮抗PGE2对小鼠混合淋巴细胞培养反应中脾细胞IFN-γ mRNA表达 的抑制作用 Fig.2 Ganoderma polysaccharides (GLB) antagonize PGE2-induced inhibition of murine splenocyte IFN-γ mRNA expression in MLR 1: Control; 2: GLB (200 mg/L); 3: PGE2 (20 μmol/L); 4: PGE2 (20 μmol/L)+GLB (100 mg/L); 5: PGE2 (20 μmol/L)+GLB (200 mg/L); **P<0.01 vs control, ΔP<0.05, ΔΔP<0.01 vs group PGE2; A: A representative gel electrophoretogram of 5 experiments. B: Percentages of IFN-γ mRNA PCR product relative to that of β-actin. 2.3 灵芝多糖拮抗PGE2对MLR中脾细胞TNF-α mRNA表达的抑制作用 在同样实验模型条件下，灵芝多糖(200 mg/L)作用8 h后可以促进TNF-α mRNA的表 达(P<0.05，n=5)，相反，PGE2(20 μmol/L)产生抑制作用(P<0.01，n=5)。在同样条件下， 在实验体系中同时加入灵芝多糖(100或200 mg/L)和PGE2(20 μmol/L)，TNF-α mRNA表 达水平比单独使用PGE要高(P<0.01，n=5)，但不能达到空白对照组的水平，表明灵芝多糖 可部分对抗PGE2对TNF-α mRNA表达的抑制作用(图3)。 图3 灵芝多糖拮抗PGE2对小鼠混合淋巴细胞培养反应中脾细胞TNF-α mRNA表达 的抑制作用 Fig.3 GLB antagonize PGE2-induced inhibition of murine splenocyte TNF-α mRNA expression in MLR 1: Control; 2: GLB (200 mg/L); 3: PGE2 (20 μmol/L); 4: PGE2 (20 μmol/L)+GLB (100 mg/L); 5: PGE2 (20 μmol/L)+GLB (200 mg/L); *P<0.05 vs control; ΔΔP<0.01 vs group PGE2; A: A representative gel electrophoretogram of 5 experiments; B: Percentages of TNF-α mRNA PCR product relative to that of β-actin. 3 讨论 MLR是同种异型抗原刺激诱发的特异性细胞免疫反应模型，具有特异性免疫应答的一 般特征。在MLR过程中，伴随多种细胞因子基因的表达与相应蛋白质产物的合成与分泌， 如白介素-1、白介素-2、IFN-γ、TNF-α等，这些因子在机体的防御机制中发挥重要作用。 因此，用这一模型进行实验所得到的结果具有较好的临床参考价值。 IFN-γ是重要的Th1型细胞因子，通过调节数百种不同基因的表达而发挥其效应[8]。 肿瘤病人血清中IFN-γ的水平通常比正常人低[9][10]。体外实验证明PGE2抑制人外周血细 胞[11]、T细胞[12] IFN-γ的产生，因此，PGE2被认为是肿瘤病人内源性免疫抑制因子。本 研究发现，PGE2可抑制MLR中脾细胞IFN-γ mRNA的表达，进一步从基因表达水平证 明了PGE2抑制IFN-γ产生的机制。另外，灵芝多糖可部分拮抗PGE2对MLR中脾细胞IFN- γ mRNA表达的抑制作用。由于IFN-γ是重要的内源性抗肿瘤细胞因子，而灵芝多糖对肿 瘤细胞没有直接的细胞毒作用，但在整体条件下却具有明显的抗肿瘤效应，因此设想拮抗 PGE2对免疫细胞IFN-γ mRNA的表达可能是灵芝多糖抗肿瘤的机制之一。 大量研究表明TNF- α在抗肿瘤方面发挥重要作用。在多种情况下，PGE2抑制巨噬细 胞产生TNF-α[13][14]，从而削弱这一宿主自身的抗肿瘤机制。本研究显示，灵芝多糖可部 分拮抗PGE2对MLR中脾细胞TNF-α mRNA表达的抑制作用，提示这一作用可能是灵芝 多糖抗肿瘤作用的另一机制。 总之，本研究证实灵芝多糖可部分对抗PGE2对小鼠脾细胞IFN-γ和TNF-α mRNA 表达的抑制作用，提示灵芝多糖抗肿瘤作用与拮抗PGE2的免疫抑制作用有关。 参考文献: [1]王庆彪, 雷林生, 孙莉莎, 等. 灵芝多糖体外对小鼠脾细胞IL-2, IL-3 mRNA表达的 影响[J]. 中国药理学通报, 1998, 14(4): 342-4. 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