硕士论文-胚胎植入前遗传学诊断在优生遗传学中的应用

硕士论文-胚胎植入前遗传学诊断在优生遗传学中的应用 兰州大学 硕士学位论文 胚胎植入前遗传学诊断在优生遗传学中的应用 姓名:刘棍 申请学位级别:硕士 专业:生殖医学 导教师:张学红 20070501 兰州大学硕士研究生学位论文 缩略词表 (按英文字母顺序排列: Assisted reproductive technique Controlled ovarian hyperstinulation Chromosome enuneratlon probe Day CEP D 染色体计数探针 天 6-diamidino-2-phenylindole DAPI 4', 6-二教基-2-苯基嘲 dithiothreitol DTT llSfe Fluorescence in situ hybridization FISH Fluorescein isothilcyanate FITC 荣光原位杂交 异硫紙酸秕光素 Follicle-stimulating hormone Germinal FSH 促卵泡激素 生发泡 vesicle GV 促性腺激素释放激素 Gonadotroph!n releasing hormone agor GnRH-激动剂 hour 小时 a h huioan chorionic gonadotrophin 人线毛膜促性SS激素 4-(2-Hydro*yethyl)-I-piperazineethanesulfonic acid 轻乙基派嘆乙确酸 HCG human menopausal gonodotrophin 人绝经期促性腺激素 HEPES human serum albumin 人血清白蛋白 HSA human tubal fluid 人输卵管液 HTF intracytoplasmic sperm injection 卵胞架内单精子显微注ICSI 射 IVF-ET in vitro fertilization-embryo transfer 体夕卜受精. LSI locus specific identification 位点特异性 in meiosis I 第一次减数分裂中期 Mil meiosis II 第二次减数分裂中期 NP-40 Nonidet P-40 乙基苯基聚乙二醉 PB phosphate buffered salince polycystic ovary syndrome 多囊卵巢综合征 PBS 兰州大学硕士研究生学位论文 PCR polymerase chain reaction PN pronucleus 原核 PVP polyvinylpyrrolidone 聚乙炼 Itt 略院 丽 RT room temperature 室温 sec second 秒 SSC citrate standard salince 梓檬酸纳缓冲 液 TR Texas Red Tween Polyethylene glycol sorbxtan monolaurate 胚胎植入前遗传学诊断在优生遗传学中的应用 硕士研究生:刘琨 导 师: 张学红 兰州大学第一医院生殖医学研究中心,兰州730000 摘要 目的:建立一套对体外受精获得的胚胎卵裂球进行秕光原位杂交为基础的分子 细胞遗传学技术帄台,发展西北地区胚胎植入前遗传学诊断技术,更早的杜绝 遗传病患儿出生,实现辅助生殖技术与遗传优生和谐发展, 本研究分成三个部分,主要实验如下: 本研究经甘肃省伦理委员会讨论后实施,收集2006年9月至2006年12 月于兰州大学第一医院生殖医学研究中心签署知情同意书实施体外助孕患者, 在常规体外受精和/或卵胞奖内单精子显微注射后将废弃的精子和胚胎捐赠用 于科研, 1. 常规体外受精后16-18h观察卵母细胞受精情况:有两个极体和两个清楚的 原核为正常受精,常规序贯培养至第三天,根据胚胎综合评分予以移植或冷冻; 观察到3个或3个以上的原核为异常受精,常规培养三天,即6-8细胞期胚胎 用于本组研究。将同一胚胎内活检的单核卵裂球随机分成两组,分别采用传统 的低渗-固定法:0. 2mg/ml BSA/1%梓樣酸 兰州大学硕士研究生学位论文 钠-0.1% Tween-20/0. 01N HCl-Carnoy 固定剂:和改良的直接固定法:0.5%Tween 20/0.01N HCl-Carnoy固定剂:两 种方法将单个卵裂球固定在载玻片上,用X/Y a卫星重复序列DNA探针进行焚 光原位杂交: 在传统细胞遗传学技术和改良的单卵裂球固定及nSH技术基础上,2. 通过调 整消化时间、竟争性DM量、变性方法:包括样本DNA/探针分开变性和共变性: 和变性时间、洗脱时间等条件,从而建立一套背景低、信号强的成熟稳定的中 期染色体和间期核:包括精子、卵裂球:的劳光原位杂交技术; 3. 在已建立的秕光原位杂交技术基础上,采用改良的单细胞固定法,以9、13 号染色体位点特异性DNA探针(LSI 9. LSI 13)和9号染色体a卫星 重复序列 DNA 探针:CEP 9),对一例核型为 46,XY,t(9;13) (q22;ql2),即 9, 13 号染 色体帄衡易位患者的胚胎进行植入前遗传学诊断。 结果: 1. 活检27枚胚胎,共167个卵裂球,其中完整卵裂球159个,活检成功率 95.21%。改良的直接固定法的单卵裂球固定率和信号检出率均为100%;传统低 渗-固定方法的固定率和信号检出率分别为95.38%和93.55%.两组固定率无统 计学差异,信号检出率存在显著性差异; 2. 在传统细胞遗传学技术和改良的单细胞固定技术基础上,建立了一套背景 低、信号强的外周血中期染色体和间期核:精子、卵裂球:秕光原位杂交的技 术帄台; 3. 对女方常规超促排卵后获取卵子10枚,活检8枚胚胎,其中3枚为正常或 者帄衡易位携带胚胎,非帄衡易位胚胎4枚,孤雌激活1枚。 结论: 1. 单卵裂球直接固定法较目前常用的低渗一固定法可以完全去除胞架,使信号 检出率更高,而且易于操作、细胞丢失率低,值得推广: 2. 秕光原位杂交具有快速、杂交特异性高、背景低和检測信号强等特点,该技 术帄台的建立将我室检測染色体异常的方法由细胞水帄提高到了分子水帄,检 測染色体异常的最早时间由妊娠中期提前到了胚胎植入前;为阐明人类早期胚 胎的发育及染色体异常形成机制提供了良好机会; 兰州大学硕士研究生学位论文 为了解西北地区的遗传性疾 病及一些常见病、多发病的遗传机理的研究 和遗传系谱的调查提供了更多的可 选择的方法; 3. 将秕光原位杂交技术成功应用于临床,对有遗传风险的不孕夫妇在 技术的基础上对胚胎进行植入前遗传学诊断,不但解决了患者辅助生殖 生育的要求,而 且避免了遗传病患儿的出生;提髙辅助生殖妊娠率的同 时,降低自然流产率和 出生缺陷率。此技术的应用在甘肃省乃至西北地 区乃是首例,对于西北地区提 高出生人口素质、贯彻优生优育政策具有 重要意义:对于人类生殖遗传学和遗 传优生学的发展也将发挥重大作用。 关键词:植入前遗传学诊断;单卵裂球;固定;秕光原位杂交:帄衡易位; 优生;遗传 The Application of Preimplantation Genetic Diagnosis in Eugenic Genetics Candidate for Master: Kun Uu Supervisor: Professor Xuehong Zhang Reproductive Medicine Research Center, the First Hospital of Lanzhou University, Lanzhou 730000, China Abstract ObjecHre: To establish a molecular cytogenetics technique platform, which based on the single blastomere FISH that from insetninatioii in vitro. To develop preimplantation genetic diagnosis (PGD) in northwest region, and eradicate the birth of heredity infanj earlier Making eugenics genentics develop accordantly with assisted reproductive tecluiique(ART). Ways: This research is composed of three parts, the main experiment methods read as follows; The research put into practice after the Gansu province ethics committee scrutiny. We collect ART patients from Sep.2006 to Dec-2006 in the 兰州大学硕士研究生学位论文 reproductive medicine research center, the first hospital of Lanzhou Uniccrsity. All discarded sperm 如d embryo from IVF/ICSI are agreed to be used for the medical science research. 1. Observe oocytes' fertilization situation at 16-18 hours after routine insemination: The normal fertilization zygotes have two polartxxlies and two clear pronucleuses. After sequential cultured for three days, these embryos were choosed to be transfeired or frozen by their integrated grades. If there are above three pronucleuses, it means abnormal fertilization. They were used for the research when they were cultured to cells embryos after three days. Distributed cells in one embryo stochastidy to two groups:hypotoiiic-fixation group and improved direct- fixation group. Hybridization with CEP X/Y when blastomeres were fixed on a piece of slide. 2. On the basis of traditional cytogenetic technique and single blastomere fixation and FISH technique’ we adjusted the pepsin digestant time, the quantity of competing DNA, denaturation inethods(indude separate denaturation and codenatur- ation) and denaturation time, washing time etc” to establish a mature and stable FISH techeique platform with low background and high signal, which include metaphase chiomosome FISH and interphase nuclear FISH (sperm FISH and single blastomere FISH). 3- On the basis of established FISH technique and improved single cell fixation, we carry out PGD with LSI 9,LSI 13 and CEP 9 to a 9,13 chromosomes balanced reciprocal tramlocation patient, his kaiotype is 461 XY,t(9;13Xq22;ql2)* 1- Biopsied 27 embryos all together, the success rate of biospy is 95.21%. single cell fixation rate and signal harvest rate arc 100% with improved direct fixation’ these two rate were 95.38% and 93,55% respectively with traditional hypotonic-fixation. 兰州大学硕士研究生学位论文 2. We established the metaphase chromosome FISH of blood and the interphase nuclear FISH (include sperm and blatomere) technique platform on the basis of traditional cytogenetic technique and improved single blastomere fixation method. 3. After 咖tin COH to the woman’ wc obtained ten oocytes, and biopsied eight embryos, in which there are 3 normal or balanced translocation embryos,other four embryos are imblanced and one parthenogenesis. 1. Single cell direct fixation has the merit of without interfere of cytoplasm, signal detect rate is higher, decrease the cell lost rate and manipulate easily eta,than the firequently-uscd hypotonic- fixation method. It deserves popularies. 2. FISH has the traits of quick、high hybridization specificity > low background and high signal etc.. Establishment of FISH technique in our lab has promoted our common cytogenetic analysis to molecular cytogenetics, move time of detect chiomosome abnormality ahead from mid trimester of pregnancy to embryo preimplantation. Supply moie chance to clarify the growth of early embryo and mechanisms of chromosome abnomalities; and more optional ways to find out genetic mechanism about inherited disease、common ailment and frequently encountered disease as well as genealogy investigation. 3- Apply FISH successfully to clinic diagnosfe, carrying out PGD to infertility parents who have the genetic risk with ART at one time. Not only solve the procreation request, but also avoid the birth of inherited infant, elevate ART pregnancy rate and decrease spontaneous abortion rate and birth defects rate. Furthermore,the application of this technique is the first case in Gansu province even the northwest, so it has great meaning for enhancing diathesis of outbirth and carrying out prenatal and postnatal care policy; it will promote human ruproductive genetics and eugenics genetics greatly- 兰州大学硕士研究生学位论文 Key Words : PGD; single blastomere; fixation; FISH; balanced reciprocal translocation; eugenic; heredity 前言 随着医学事业的迅速发展,许多以前原因不明的疾病,现己认识到是遗传性 疾病或与遗传物质改变有关的疾病,遗传性疾病已成为导致新生儿死亡的主要原 因。为适应国际社会人类发展的基本要求,提高出生人口素质已成为全人类共同 关注的问题,也是我国计划生育政策的重要问题。2001年,我国已将"人类出生 缺陷”的基础研究纳入国家973研究计划,并确定了前30种优先研究的疾病。 —、PGD的发展与优生遗传学 1978年英国科学家取人的卵子和精子在体外培养使卵子受精,将发育成的早 期胚胎植入母体内,胎儿在母亲子宫内生长、发育到分挽,这是常规试管婴儿技 术,也就是人们熟知的第一代试管婴儿技术。但是,这 1】一技术无法解决男性因素 引起的不育,成功率仅20%1。1992年,科学家们借助显微操作仪把单个精子直 接注入卵细胞架内使卵子受精,即卵胞架内单精子显微注射技术(intracy- toplasmic sperm injection, ICSI),也称之为第二代试管婴儿技术,男性不 育迎刃而解,成功率达50%13。但随着试管婴儿技术成功率的提髙,胎儿畸形的 风险也随之提髙,尤其是男性不育患者 3携带的遗传缺陷的风险和生殖细胞畴变的 比率明显高于正常人群I】,ICSI技术的出现增加了这搜遗传缺陷传给后代的可能 性。因此,遗传学在生殖医学尤其是不孕症的治疗中占有越来越重要的地位。第 三代试管婴儿技术-一胚胎植入前遗传学诊断:preimplantation genetic diagnosis, PGD)由此应运而生,它是在体外受精和显微操作技术基础上,结合 分子生物学发展起来的一项高新分子遗传学诊断技术。即在人类辅助生殖技术 (Assisted reproductive technique, ART)基础上对早期的植入前胚胎进行遗 传学诊断,选择健康胚胎移入母体,避免异常胚胎的移植和着床,使遗传病基因 携带者夫妇在怀孕前洶汰患病胚胎,避免遗传病患儿的出生,降低自然流产发生 率,避免选择性流产和多次流产对妇女及其家庭带来的危害及伦理道德观念的冲 秕,为更有效地防止遗传病提供了方法。 目前,全世界新生儿先天崎形发生率为1.73%,中国为1.3%,其中20%-30% 4是 由染色体异常或单基因缺陷所致f〗。RubioP"发现在反复或习惯性流产 兰州大学硕士研究生学位论文 病人中有 71%为染色体异常。染色体异常包括数目与结构异常,染色体数目异常在植入前 胚胎中十分常见,是IVF成功率低的主要原因之一。约50%的自然流产是由染色 体异常所致,其中染色体三体占50%-52%, X单体占15%-24%,三倍体占15-22%, 四倍体占2%-7%, 4V8%为染色体结构异常1?"。大部分染色体异常庇胎在植入前发 育中被淘汰,或植入后引起自然流产、胎儿死亡及神经系统发育迟缓。新生儿染 色体数目异常95%发生在13、18、 、Y染色体尤其在高龄母亲及反复 IVP失败的不育患者胚胎的非整倍21, X 9体率升高t】.替如,21三体综合征的发病率是 1/1000- 2/1000,母亲年龄若超过37岁,其发病率是群体发病率的2倍,曾生 过此类患儿的夫妇,再 1生同类患儿的比率为i/ioo-s/ioof**^。据统计,现阶段我 国每年出生的1279 】万t”人口中,就有唐氏综合征患儿17000人,即帄均每30分钟 就有一例唐氏综合征患儿出生。 染色体易位是最常见的染色体结构异常,这种染色体异常的携带者一般没有 遗传物质丢失或丢失不多,因此表型正常,但可将不帄衡的染色体传给子代,导 致流产、死胎、崎形儿或不育。据报道,帄衡易位在一般人群中的发病率为0.2%, 在不育夫妇中占0.6%,在IVF周期反复植入失败夫 1妇中达3.2%12>。染色体相互易 位携带者生育正常后代的可能性最多只有1/18,罗氏易位携带者生育正常后代的 可能性最多只有1/6;绝大多数染色体异常胚胎因自然流产淘汰,但也可能生育 染色体病患儿。同时,由于目前进行植入胜胎的选择是以形态学为基础的,然而 超过40%形态正常的胚胎存在染色体异常丨,、因此PGD技术的弓丨入可避免染色体 异常的胚胎植入子宫而导致的IVF/ICSI失败或流产,对于优生遗传学具有重要 意乂。 二、 FISH技术在染色体遗传病及预防中的应用 对于染色体病目前还没有有效的治疗措施,因此,检出染色体异常、预防染 色体患儿的出生是降低染色体病发生率、提高人口素质的主要手段。虽然传统的 染色体显带技术可鉴别单个染色体和检测大致的核型改变,但是这项技术的 大部分是依靠细胞遗传学家的经验积累和主观解释,对 兰州大学硕士研究生学位论文 于没有标记的染色体具有 复杂的带型,许多隐秘的易位、小的插入、小的倒位、小的扩增和微小缺失常常 难以检测,因而不能精确分析。此外,染色体分析的前提是必须获得大量中期分 裂相,但有些细胞分裂相很少甚至是不分裂的细胞,例如实体瘤和人的配子:成 熟的精子和卵子),要获得其中期染色体是非常困难的。鉴于传统细胞遗传学的 局限性,人们在传统的细胞遗传学基础上结合DNA技术,发展了一门新的学科一 “^)"子细胞遗传学(molecular cytogenetics). Flourescence in situ hybridization, FISH)作为一门新 兴的分子劳光原位杂交: 细胞遗传学技术,是20世纪80年代末在原有的放射性原位杂交技术的基 础上发展起来的一种非放射性原位杂交技术。它用已知的标记单链核酸为探针, 按照减基互补的原则,与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合,形成可被 检測的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列, 因而可以将探针直接与染色体进行杂交,从而将特定的基因在染色体上定位,详 细说明染色体秕变情况。与传统的放射性原位杂交相比,FISH具有快速、检测 信号强、杂交特异性高和可以多重染色等特点,使得从分子水帄上研究染色体的 结构、畸变、遗传效应与疾病的发生得以开展。例如,不明原因的智力低下在人 群中的发生率高达1%" 3%1『\而其中5% -8%的病人可应用HSH检测出许多过去单 靠核型分析难以发现的微小易位、复杂易位、末端区域的隐匿易位等,并发现了 一些新的染色体综合征。此外,FISH不仅可以以目的基因为探针,对中期染色 体进行杂交,确定该基因在染色体的位置,而且可以用于动、植物基因组结构 1的 研究和DNA分子物理图谱的构建Ps’?^ FISH不但可以用于中期染色体,而且可以应用于间期细胞核;不但可以用于 出生后的诊断,还可以用于产前和植入前胚胎的诊断。1990年,第一例运用nSH 对植入前胚胎进行性别鉴定的婴儿顺利出生,此后,FISH技术在PGD领域得到广 泛运用。对性连锁隐性遗传疾病基因携带者进行植入前性别鉴定,选择适宜胚胎 植入子宫可避免患儿的出生;研究表明iq髙龄妇女发生遗传异常妊娠及流产的危 险增高,胚胎染色体异常也是高龄 兰州大学硕士研究生学位论文 妇女IVP失败的主要原因,因此对高龄妇女进 行IVF治疗时,结合PGD技术,可减少与年龄相关的染色体异常胚胎移植,增加IVF 成功率;对于IVP反复失败和反复流产的患者,用PISH对胚胎进行PGD,选择 形态正常和染色体正常的移植,可以提高胚胎成活率,减少移植胚胎数目而避免 多胎妊娠。因此,用FISH技术对移植前胚胎进行PGD,可以防止严重的遗传病, 具有重要的临床价值,对于提髙出生人口素质无疑具有深远的意义。 几年来,我中心已经具备成熟、稳定的辅助生殖技术,并积累了丰富的细胞 遗传学研究的经验。在此基础上,进一步建立以FISH技术为基础的分子细胞遗传 学技术帄台,应用于染色体病的胚胎植入前遗传学诊断,确诊传统核型分析技术 不能确定的染色体的微小结构异常和染色体结构畸变,探讨其和临床表型的关 系,将对我省乃至整个西北地区开展遗传优生工作,减少遗传病患儿出生发挥重 要的作用《 正文 第一部分单卵裂球固定方法比较 2006年9月至2006年12月于兰州大学第一医院生殖医学研究中心实 施体 外助孕患者,常规IVF/ICSI后废弃的多精受精胚胎经知情同意 后用于本研 究。 2.主要试剂: 2.1超促排卵试剂》 达菲林:GnRH-a):注射用乙酸曲普瑞林CTriptoreline), 长效制剂3. 75mg/支,短效制剂0.1 Hig/ 支, 博福益普生公司,法国; 果纳芬:Gonal-F):注射用重 组人促卵泡素:rh FSH), 75IU /支,雪兰诺生物制药有限公司,瑞士; 人绝经期促性腺激素:HMG): 75IU /支,珠海丽珠医药公司,中 国; 波热尼乐:Pregnyl):注射用线毛膜促性激素:HCG), 兰州大学硕士研究生学位论文 5000IU/支,欧加农生物制药有限公司,荷兰。 2.2胚胎培养试剂 HTF (第三代):ART-1020 HEPES-HTF: ART-1023 卵裂培 养液:ART-1026 HSA: ART-3001 无 Ca\ Mg'*培养液:ART-4100 组织培养油:ART-4008 透明 质酸,:ART-4007-A PBS: ART-4011 PVP: AR1M005-A 以上试剂购于美国SAGE 囊胚培养液:G-2,购自瑞士 Vitrolife .13. 兰州大学硕士研究生学位论文 2. 3精液处理试剂 Pureception梯度离心液:ART-2024,购自美国SAGE 2.4 FISH 试剂: Tween-20、BSA 购自美国 sigma, NP-40 购自美国 Fluka, DAPI 购自瑞士 Roche.梓樣酸钠、胃蛋白,、甲酰胺、20XSSC、PH校正液均购自上海生 工,封片胶购自美国Starkey,去离子水自制,HCl、无水乙醉、甲醇、冰 乙酸等为常规分析纯试剂。 2.5秕光探针: X/Y a卫星重复序列探针:CEP X/Y),FITC标记X染色体着丝粒DXZ1 区 域,秕光显示为绿色;Texas Red标记Y染色体着丝粒DYZ3区域, 焚光显 示为红色;购自英国MP-Bio公司。 3. 实验设备、仪器和耗材: 全数字化超声仪:Aloka SSD-1000,日本 取卵粟:COOK K-MAR-5100,美 国 取卵针:Wallace,美国 Grant QBD 1,英国 Galaxy A,英国; FORMA 3308,美国; 桌面培养箱:nV—6,法国 CO,浓度测定仪, Labotect 1050,德国 * 超净工作台:K-SYSTEMS 2100,丹麦 解剖显微镜:Nikon SMZ800,日本 相差显微镜:Nikon E200,曰本 显微操作系 统:RI,英国 显微操作针:Huraangen,美国 卵裂球活检 针:Cook,美国 激光系统:OCTAX,德国 秕光显微镜:Nikon 80i,曰本 染色体图像分析系统:Cjrtoscan,美国 .14. t州大学硕士研究生学位论文 杂交炉:Thermo Brite S500,美国 MilliHJ Biocel 超纯水 仪:Millipore,美国 微量加样枪:Nichipef EX,日本 电 子天帄:Mettler AB 104-S,瑞士 PH计:OAKTON,新加 坡 Marker 计数板:Cell-VU? DRM-600,美国 台式离心 机:CT6T型,上海科学仪器有限公司 祸旋混合器: XW-80X型,上海第一医学院仪器厂 恒温水浴箱: 420-C型,姜堰市新康医疗器械有限公司 冰箱:新 飞BCD"183KT,中国 各种规格培养皿、离心管: Falcon,美国 巴氏吸管:Sigma,美国 钻石笔、PCR管、 载玻片、盖玻片、 (二〉方法 1. 促排卵 1.1黄体期长方案: 【月经前7-10天’即月经周期的黄体中期根据患者基础状态1矶给予长效达菲 林0.9-1.8mg降调节,当各项指标提示降调节达标一一血清LH<5IU/L,血清 E,<20pg/ml;阴道B超监测卵泡直径<0.5cm,子宫内膜厚度<0. 5cid ,开始注射 rhFSH和/或HMG, 75IU-300IU/曰:同时予以补佳乐2mg-4mg/日口服滋养内膜。 1.2短方案: 月经周期第2天同时给予短效达菲林0.05mg - 0.1 mg/日和rhFSH和/或 HMG75III-300III/日直至HCG注射日;同时予以补佳乐2mg-4mg/日口服滋养内膜。 2. 促排周期监测 Gn 3天后幵始阴道B超监测卵泡发育和子宫内膜增长情况,隔日一次;优 势卵泡直径达1.4cm时,改为每日监测;阴道B超监测卵泡直径达2. OcmX 1个, 1.8cmX2 个,1.6cniX3 个时,停止 Gn,给予 HCG 5000-1000011] 肌注,36h 后 取卵,依次于Gn第4天、第8天、停Gn日,取卵日清晨空腹釆血检测血清性 激素,结合卵泡生长和内膜发育情况指导促排方案调整和个体化治疗;取卵术 后给予适量黄体_和达夫通黄体支持。 -15- t州大学硕士研究生学位论文 3. 卵子采集 HCG注射后36h在阴道B超引导下行秔刺取卵术,将秔剌出的卵泡液倒入 60?培养皿中,在装置37X:恒温热板的超净工作台内的解剖显微镜下选卵,同 时观察卵母细胞成熟度。将选出的卵子先置于HEPES-HTF培养基中洗去可能带 有的红细胞,再将其转入盖油的5% HSA/HTF培养基中,取卵结束后将所有的 卵子转入另一个干净的5%HSA/HTF培养基,置371C, 5% C02培养箱辉育3-6h, 等待受精。 4. 卵母细胞成熟度判定 4.1 GV 期: 未成熟卵子。放射冠细胞紧密地附着于透明带,颗粒细胞致密,卵胞 架内 可见生发泡,体积较大,具有折光性,胞质中央发暗,并有颗 粒感; 4.2 MI 期: 放射冠细胞轻度扩散,颗粒细胞密集,卵胞衆内生发泡消失,但第一极体 尚未排出,胞质透明,含均质颗粒; 4.3 Mil 期: (1) 排卵前:即成熟卵,受精率最髙。放射冠细胞扩展成放射 状,颗粒细 胞疏松聚集,细胞核结构消失,第一极体排出,胞质呈 均质颗粒,颜色透 明光亮; (2) 过熟卵:卵子表现为一个苍白的球体,放射冠细胞较少或 已从卵子周 围脱落’颗粒细胞量仍较多; (3) 黄素化卵:卵子非常苍白,受精率很低,颗粒细胞裂解, 形成胶状体 包裹在卵子周围: (4) 闭锁卵:颗粒细胞破碎,形成花边状包围着卵子,胞架很黑。 5. 精子准备 5.1精液采集:禁欲3-7天,取卵当天上午清洗外阴、双手,在无菌室内手淫 取精,精液收集在专用无毒、无菌取精杯内,立即送入精液处理间,室温液化 后,按WHO (第四版:标准进行精液分析: 5. 2精液处理: -16- 兰州大学硕士研究生学位论文 (1) 在装有1.5flil 80% Pureception的15ml离心管中沿管壁缓慢加入1. 5ml 40%Pureception,使两层溶液中间形成一个清晰的界面;将液化的精液同法缓 慢加入离心管内; (2) 3000rpm/min离心15min,去除上清,将底部含精子的沉淀物转入装有2ml 5%HSA/HTF的离心管中,混勾,ISOOrpm/min离心4min; (3) 去除上清,将精子沉淀同步骤(2)再离心2次; (4) 去除上清,将精子沉淀转入含有0.4-0.6rol 5%HSA/HTF的圆底试管内, 混勾,置于371C, 5%C02培养箱备用。 5.3畢丸精子处理: (1) 根据取卵曰获取的卵子数量和男方華丸发育情况活检适量的曲细精管,在 HEPES-HTF培养基中洗去點附的血液后,用无菌空针针头划碎,倒置显微镜下 寻找成热精子; (2) 将划碎的曲细精管和HEPES-HTF培养液2-3ral转入15ml离心管, 1500rpm/miri 离心 4min,去上淸,加入 1.5ml 5%HSA/HTF,混匀,置 371C, 5%C0j 培养箱辉育3-4h; (3) 将离心管取出,再离心一次,1500 rpm/min, 4min,去上清: (4) 加入少许5%HSA/HTF,将底部沉淀混匀,置371C, 5%C02培养箱待ICSI* 6.受精 受精方式:IVF/ICSI)根据取卵当日精液情况以及患者的临床指征进行病 例讨论后决定- 6.1 IVF: (1) 调精:用Maker 板计数活动精子数目,计算调密度为1. 4?1.6X lOVL 的受精液所需的精液量,用移液枪吸取所需的量移入标有患者姓名 的装有 5%HSA/HTF的试管中丨混匀后,再用Maker板检查精子密度 是否符合,如 不符,则继续调节;再用调好密度的受精液在有患者 兰州大学硕士研究生学位论文 姓名的受精皿中做数 个受精滴,盖油后置于371C,5%C02桌面培养箱帄衡10分钟; (2) 加卵:将卵子加入精子微滴中,每个精子微滴中加卵子1-2个;将培 养皿放回37'C, 5%C02培养箱; (3) 棟卵:1.5h-2h后,将卵子从受精皿中榜出,转至另一个帄衡好的 兰州大学硕士研究生学位论文 5%HSA/HTF培养基后迅速放回培养箱继续 培养。 6.2 ICSI: 卵子准备: (1) ?将卵子从培养箱中取出,转入含透明质酸_溶液的培养皿中,用内径约 120?的毛细吸管反复吹吸,去除卵子周围的颗粒细胞,操作时间不 Imin; 超过 ?立即将卵子转入5%HSA/HEPES-HTF反复吹吸,去除透明带上残留的教 溶液和點附的颗粒细胞; ?观察卵母细胞的透明带、胞架、生发泡和第一极体情况,评估卵母细胞 的成熟度;将Mil期卵子转入5%HSA/HEPES-HTF显微注射皿中准备行ICSI; 未成熟卵子转入5%HSA/HTF培养皿,置培养箱继续观察; (2) 显微注射过程: ?显微操作针装置:参见显微操作系统说明书); ?精子制动:在显微操作皿中的每一滴5%HSA /HEPES-HTF培养液中加入一 个Mil期的卵母细胞,然后将显微操作皿置于371C恒温的显微操作帄台上, 在200X的显微镜下,先将视野调至中央的精子-PVP滴液面的边缘,选择一 条活动的形态正常的精子,将注射计稍微抬髙后,垂直放于仍在活动的精子 尾部的中点,慢慢下压,随即将注射针快速拉过精子尾部,精子立即被制动。 被制动的精子先尾后头吸入显微注射针内,然后将显微注射针转至含有卵母 细胞的培养微滴中; ?卵胞浆内单精子注射:用显微固定针固定卵母细胞,将显微注射针与卵母 细胞均调节至最清晰状态,卵母细胞的极体位于12点或6点位置。使注射 针对准与卵母细胞正中的3点位置,将精子推至注射针尖端处,注射针垂 直秔越透明带及卵母细胞胞菜膜进入胞架内,回吸部分胞桨至胞装膜破裂, 然后将回吸的胞菜连同精子以及尽量少的PVP —起小心注入胞浆,迅速撤出 注射针。 7.受精情况观察 受精后16-18h观察卵子的受精情况。如果有两个极体和两个清楚的原 核, 表明正常受精,根据胚胎综合评分予以移植或冷冻;观察到3个或 3个以上的 .17- 兰州大学硕士研究生学位论文 原核则为异常受精,常规培养三天,即6-8细胞期胚胎用于本组研究。 8.卵裂球PISH 卵裂球FISH包括三项技术:?胚胎活检:?单卵裂球间期核固定:?FISH 诊断。分别详述如下- 8.1工作液准备: 低渗液:0.2mg/ml BSA/1%^檬酸钠 2XSSC:用去离子水将 20XSSC稀释10倍,PH7.0 变性液:70%甲酷胺/2XSSC, PH 7.0-8.0 0.5mg/ml胃蛋白50mg胃蛋白酶溶于100ml 0.01N HC1 固定液 I: 0. 1% Tweeir-20/0.01N HC1 固定液 II: 0.5% Tween-20/0.01N HC1 固定液III (Carnoy固定液):甲醇: 冰乙酸=3: 1 冼脱液 I: 0.4XSSC/0.1% NP-40, PH 7.0 洗脱 液 II: 2XSSC/0.3% NP-40, PH 7.0 5N NaOHs 120g NaOH 溶 于 600ml tfeO 8.2卵裂球活检 (1) 将胚胎从卵裂期培养基中转至无Ca”、培养基中,放置37X; 桌面 培养箱培养5-10 min,使卵裂球之间的连接松散; (2) 将胚胎转入显微操作皿中,用固定针固定卵母细胞,预活检 的卵裂球 位于3点位置; (3) 用波长1.48um的OCTAX远红外激光在预活检卵裂球外侧的 胚胎透明 带处打孔,用内径30um的口径光滑的活检针经孔进入透明 带,轻轻推向 .卵裂球,使活检针口四周无缝隙,缓慢向回抽吸吸入少量胞质,同时向 透 明带外牵拉,在卵裂球经过透明带时,如果卵裂球将从活检针口 脱离,可 缓慢增加气压操作杆内压力,使1/4-1/2体积的卵裂球进入 针内,再次轻 轻向外牵拉直至卵裂球与胚胎完全脱离; (4) 将活检计连同针内的单个卵裂球一起转至活检液滴旁边的 培养液滴 内’将卵裂球缓慢排出活检针;同法活检下一个卵裂球。 8. 3单个卵裂球固定 .18- 兰州大学硕士研究生学位论文 将载玻片置于倒置显微镜下观察,表面无明显异物。用钻石笔标记固定区 域,分别编号。将同一胚胎内活检出的单核卵裂球随机分成两组: A组:低渗-固定组):将单个卵裂球转入装有0. 2nig/ralBSA /1%梓檬酸钠低 渗液的培养皿中低渗5inin,然后转移至清洗干净的无油的载玻片上标定的区域 内,并在卵裂球干燥形成结晶前反复滴加0.1% Tween-20/0.01N HC1,同时在 倒置显微镜下观察细胞膜破裂、间期核游离,即将干燥时再在载玻片上滴加几 滴新鲜配制的甲醇/冰乙酸,自然干燥,待杂交; B组:直接固定组):将卵裂球转入装有0.5% Tween-20 /0.01N HC1的培 养皿中,在倒置显微镜下可观察到胞膜破裂、胞衆逐渐溶解扩散,核游离出, 此时立即将间期核转移至载玻片标记区域内,即将干燥时滴加几滴新鲜配制的 甲醇/冰乙酸,自然干燥,待杂交, 8.4 FISH 诊断- (1)消化: ?如果卵裂球细胞核表面和/或周围覆盖较多残留胞衆,则依次置于 2XSSC, lOmin; PBS, 5 min: 0.5mg/nil 胃蛋白3TC, 5min,消化去 除多余的胞菜成分,使探针能更好的与祀DNA杂交;立即将样本玻片放入 PBS终止蛋白糖消化反应;5 min后将玻片置于70%、90%、100%酒精依 次脱水2 min,自然瞭干,待FISH检测; ?如果卵裂球细胞核表面和/或周围没有残留胞衆,则样本玻片不需要 经过胃蛋白海消化,在2XSSC和PBS帄衡后,直接置于70%、90%、100% 酒精依次脱水,自然瞭干后待用; (2)变性和杂交: ?祀DNA、探针分开变性,杂交: A、样本玻片置于70%甲酸胺变性液中,73士 1"C变性5rain,立即投入 70%, 90%、100%酒精中脱水各2niin,置于45r培养箱烘干; B、同时探针73 土 1TC变性5min,立即放入冰盒中冰浴; C、将10 ul探针加在已经干燥的变性玻片上,加盖玻片,封片,注意避 兰州大学硕士研究生学位论文 免产生气泡,置于湿盒内,37"C杂交过夜; ?祀DNA、探针共变性,杂交: 兰州大学硕士研究生学位论文 将lOul探针加在干燥的样本玻片上,加盖玻片,封片,置于杂交炉 内 73'C共变性5rain, 37X:杂交过夜,注意保持杂交炉内的湿度; (3) 洗脱: 去盖玻片,将玻片立即投入洗脱液I中,73'C,2min;转入洗脱液II 中, RT, 5-30sec;取出玻片,垂直放在暗室的吸水纸上直至完全干燥; (4) DAPI 复染: 将lOul DAPI加在样本玻片上杂交区域,覆盖盖玻片,复染lOmin; (5) 阅片和拍照- Nikon 80i秕光显微镜下观察杂交结果,秕光信号的判断标准:?核无 重 叠;?信号强弱一致,不计算弱杂交点;?与其它秕光信号完全 分开算为 单一信号;如果信号有分裂,但两个信号非常接近,互相 有交叉或并排排 列,两者之间的距离小于信号大小的一半则判断为 一个信号。对结果进行 分析,拍照存档- 9.统计学方法- 2采用SPSS 12.0软件,行;tr检验。 1.胚胎活检情况 活检27枚胚胎,共167个卵裂球,其中活检出完整细胞159个,活检成功 率获得含单个间期核卵裂球130个。:见图1) 2. 单卵裂球固定率比较 A组固定卵裂球62个,B组固定卵裂球65个,固定率分别为95. 38%(62/65)、 100% (65/65).两组无显著性差异。 3. 卵裂球FISH信号检出率 焚光显微镜下,用UV滤色片组可见DAPI复染后单细胞间期核呈蓝色秕光。 以X、Y探针杂交的单卵裂球PISH中,用绿色滤片组观察两个绿色秕光信号, 表明为女性胚胎;分别在绿色滤色片组和红色滤色片组观察到一个绿色秕光信 号和一个红色秕光信号则表明为男性胚胎,其它秕光信号组合则为性染色体异 常胚胎。两种固定方法的信号检出结果见附表1,信号检出率分别为93.55% (58/62), 100% (65/65),有显著性差异:P<0.05),(见图 2) .20- 兰州大学硕士研究生学位论文 3原核胚胎卵裂球X/Y双色FISH结果 秕光信号结果 XY XX m XXY m XXYY XXXY 27 12 25 37 比例? 21.26 9.45 19.69 29.13 12.60 5.51 2.36 (四:讨论 FISH技术是近几年发展起来的一种分子细胞遗传学技术,其基本原理是利 用滅基的互补性,将特异退火的焚光素标记的单链核昔酸与染色质和/或染色体 已分离固定标本中的核酸序列互补杂交,通过荣光显微镜采集秕光信号从而对待 测核酸进行定性、定位的方法。它具有发现常规细胞遗传方法无法检测的基因或 染色体重排,可检测间期核的染色体异常,不需要培养细胞仅对单个细胞即可进 行DNA定位,在较短的时间内为临床提供相关的信息等优点,因而在染色体生 物研究中具有十分重要的价值。 用nSH分析植入前胚胎的染色质前提是要获取单个卵裂期以及单个细胞的 固定。目前对植入前胚胎染色质结构进行分析的取材主要有四个方面:第一极体、 第二极体、8细胞期卵裂球、囊胚滋养层细胞。极体是卵母细胞成熟分裂的产物, 既不参与胚胎的发育,又无任何已知的功能,极体活检及其遗传学分析可在获卵 后48h内完成,因而具有较髙的时效性和安全性,但极体仅含有母源性遗传物质, 不能检测父源性基因或染色体组成,不能确定胚胎性别,而且细胞分裂时可能发 生染色体交换,误导卵母细胞基因型的判断IW。因此,目前极体活检主要应用于 妇女年龄相关的卵母细胞染色体数目异常分析。囊胚期滋养层细胞一次可提供 10" 30个细胞,克服了极体和卵裂球活检可提供遗传分析材料较少的不足,同时 可以进行胚胎染色体核型分析,理论上具备较好的应用前景。但胚细胞的核型和 胎,的核型可能不一致,以及囊K活检后遗传学分析所需时间与活检后的胚胎移 植窗口期时间之间的矛盾,因而这种方法仍然受 【2】到很大限制?。卵裂期胚胎具有 全能性,从8细胞期卵裂胚胎活检1-2个细胞,不会明显影响胚胎的进一步发育。 此外,人8细胞期卵裂胚胎具有较高的囊胚形成率,活检胚胎,再经囊胚培养后 移植,可以获得相对宽裕的遗传学分析时间。因此,本研究选择取卵后第三天发 育至6-10 .21- 兰州大学硕士研究生学位论文 细胞期卵裂胚胎进行活检。活检成功与否包括两方面tM:?获取完整的 卵裂球,而且有单个清晰可见的核;?活检过程不影响胚胎的进一步发育。然而, 一般分裂期胚胎发育至8-16细胞期时,卵裂球之间幵始形成紧密的连接,使细胞 这时如果直接进行卵裂球活检,势必因为活检困难而致卵裂球裂解并 对活检胚胎造成极大损伤-因此,对于细胞间连接较为紧密的胚胎需要在无 Mg"培养基中培养5-lOmin,使细胞间连接松散再行活检。同时,整个活检操作时 间不能过长但要有足够的耐心,活检针进入胚胎后缓慢增加压力,防止压力骤然 改变损伤细胞。 弗裂球间期核良好的固定是FISH成功的关键,判断单个细胞固定是否成功 主要有两点:?确保间期核被固定在载玻片上;?探计能与间期核内染色质特 异性结合,提供清晰、可靠的信息以供明确诊断。最初的单细胞固定是在细胞 逋传学的基础上发展起来的,即将单个细胞在0,075MKC1内低渗后转移到载玻 片上,再往细胞周围滴加新鲜配置的Carnoy固定液。然而,由于0.075M KC1 渗透压相对卵裂球细胞渗透压极低,细胞迅速膨胀,不到2分钟质膜便破裂, 而且Carnoy固定液流动性大,挥发迅速,细胞极易丢失。1994年Coonen 发现T?een/HCl固定液可大大降低细胞丢失率,因此,该方法被很多实验室采 纳并在此基础上做了进一步改良。目前较为常用的方法是将卵裂球在BSA/1%梓 檬酸钠低渗液内低渗5ffiin使细胞膨胀,再用Tween/HCl和/或甲醇/冰乙酸进行 固定,具有细胞丢失率显著降低、胞菜去除较为彻底、操作易为掌握等优点。 由于兰州气候较为干燥,空气湿度低,本中心在用该方法固定时发现将卵裂球 从低渗液转移至载玻片上的过程中:无论是否先在载玻片上滴加一小滴固定 剂),固定液极易蒸发,在载玻片表面形成结晶,胞浆亦干燥敏缩覆盖在间期核 上,干扰秕光探针秔透核膜与染色质的特异性结合;而增加转移的液滴量易导 致细胞随液体漂移,以至在倒置显微镜下不易跟踪观察甚至丢失。本实验用此 固定方法:A组:时丢失3个卵裂球,顺利固定的62个细胞中有7个卵裂球在 反复滴加Tween/HCl和甲醇/冰乙酸后,仍有较多胞质残留。利 .22- 兰州大学硕士研究生学位论文 用胃蛋白酶消化 可以去除残余的胞质,但胃蛋白酶生物活性存在批次的差异性,以及细胞自身 对酶反应有个体差异性,因此对于_的实际浓度和消化时间很难控制;而且每 张玻片上固定细胞的胞浆残留量不同,相应的所需的_消化时间也不同,消化 不足会影响探针的特异结合,而消化过度则导致样本DNA不同程度降解致使标 本不适合杂交:减少每张玻片上固定的细胞数必将造成探针用量明显增加。此 外,我们在固定过程中还发现部分间期核秕然发生域缩,这就会使得细胞核自 .23- 兰州大学硕士研究生学位论文 身的三维结构保留,信号处于不同的聚焦帄面或重叠,导致信号的错误判断。 Tween-20是一种非离子型表面活性剂,其分子结构包括一个亲水区和一个 疏水区,但又不同于脂质样小分子,它只有一条疏水区,在水中趋向形成一小 族。当过量的Tween-20与膜结合时,Tween-20分子的疏水端与跨膜蛋白的跨 膜疏水区结合,也与碟脂分子的疏水尾部结合,因而将蛋白质与憐脂分开。因 为TVeen-20另一端是亲水的,所以这种结合趋向于把膜蛋白以蛋白质与表面 活性剂的复合物形式带进溶液,同时溶解礎脂。而盐酸能使碱性蛋白变性,避 免碱性蛋白与探针之间的非特异结合而降低背景。因此,本研究利用TVeen-20 和HC1的这种特性,将卵裂球不经低渗,直接转移到Tween-20/HCl中,同时将 Tween-20的浓度由0.1%增加至0.5%以减少作用时间,15s-20s后在倒置显微镜 下即可观察到胞膜破裂、胞奖逐渐扩散,间期核游离出,此时立即将游离出的 细胞核转移到载玻片上,待液滴蒸发即将干燥前滴加少许甲酵/冰乙酸防止 Tweeri-20蒸发后在核周围形成的结晶。这种直接固定方法因为不需低渗,不需 往载玻片上反复滴加固定剂减少了细胞丢失的可能,而且完全没有胞质残留, 不需蛋白海消化,保证了间期核DNA的完整性;其次,即使在活检吸拉过程中 不慎造成弗裂球胞菜严重破损,只要完整的核存在仍然可以进行固定;转移至 载玻片上后,细胞核也不会随着固定液的流动和蒸发发生变性或敏缩,而是铺 展在同一帄面并保持良好的形态同时改良的固定方法简化了操作程序,缩 短了操作时间,易于操作。准确的单卵裂球固定,是FISH和PGD成功的关键, 因此,改良的固定方法为我们焚光原位杂交技术帄台的建立和PGD的临床应用 奠定了坚实的基础,是种值得推广的方法。 兰州大学硕士研究生学位论文 第二部分秕光原位杂交技术帄台的建立 1. 样本来源 外周血取自2006年9月-2006年12月于兰州大学第一医院生殖医学研究 中心签署知情同意书实施体外助孕患者; 常规体外受精和/或卵胞菜内单精子显微注射后废弃的精子和胚胎经知情 同意后用于本研究《 2. 主要试剂 2.1细胞培养和染色体制备试剂: RPMI-1640培养基购自广州达辉生物技术有限公司;秓水仙素、姨海、酷 红、Gimesa等为一般细胞培养用试剂;甲醇、冰乙酸、KC1等为常规分析纯试 剂。 2.2 FISH 试剂: NaOH、HC1、乙醚等为常规分析纯试剂:其它试剂参见第一部分. 2.3探针 名称 焚光标记 标记区域颜色 厂家 CEP 9 Spectrun Orange 9qU-pIl LSI 9 Spectrun Vysis 美国橙色 Aqua 9q34 LSI 13 Spectrun Green 13q34 美国Vysis 青蓝Xpll-qll(DXZl)/ 美国Vysis 色 绿CEPX/Y FITC/Texas Red Ypll-qll (DYZ3) 色 绿 上述探针均为直接MP-Bio 色 红标记, 3.主要仪器与设色 备 参见第一部分。 (二: 方法 1.外周血中期染色体 FISH 1.1中期染色体玻 片制备: 兰州大学硕士研究生学位论文 常规方法培养人外周血淋巴细胞72h,收获前2-3h加入秓水仙素,使大部 分的染色体有丝分裂停滞在中期;常规收获细胞并制片,置于37X:恒温箱,24h 兰州大学硕士研究生学位论文 后直接FISH检测或-2(rc保存备用; 1.2 消化: 将染色体玻片从-201C取出,恢复至RT,或者新鲜制备的外周血玻片,置于 2XSSC lOrain? PBS 5 min;转入 O.Smg/ml 胃蛋白酶,37*0, 5min,除去多余 的胞架成分,使祀DNA能更好的与探针杂交:立即放入PBS 5 min终止81反 酒精各2 min,风干; 1.3变性、杂交: 应; 再放入70%、90%、100% 同卵裂球FISH,采用分开变性或共变性,杂交; 1. 4洗脱: 去掉盖玻片,将玻片立即投入洗脱液I中,731C. 2min5放入洗脱液II中, RT, 5-30sec;取出玻片,垂直放入暗室的吸水纸上直至完全干燥; 1. 5 DAPI复染,秕光显微镜下信号检测: 将lOul DAPI加在玻片上杂交区域,覆盖蓋玻片,复染lOmin。在Nikon 80i 秕光显微镜下观察杂交结果,并拍照。 2. 精子FISH 2.1精子标本制备- (1) 精液分析:将新鲜或冻存精液按 WHO (第四版:标准进行精液分析; (2) 精液洗漆:取精液标本,用2倍于精液体积的PBS缓冲液1500rpm/min, 5min/次洗漆2次,去上清;往精子沉淀内加入少许5% HSA/HTF 2d!1吹打 混勾,缓慢滴加培养液调整精子密度至1?2X10Vml; (3) 滴片:取一滴已调至合适密度的精子悬液在玻片上方垂直滴下,使 精 子均勾分布于玻片上,自然干燥; 2.2精子核去凝集: 将制备好的精子玻片置无水乙醇/乙继:1 : 1)中固定5miri后,投入5N NaOH 3raim观察精子的肿胀情况,直至精子头部体积是原来的2倍,而且精子头呈 圆形、饱满:去离水终止NaOH反应,置2XSSC中帄衡lOmin,自然干燥; 2.3精子荣光原位杂交- (1)脱水:用钻石笔在去凝集的精子玻片背面标记杂交区域,依次在70%、 90%、100%酒精脱水各2niiti,自然干燥; 兰州大学硕士研究生学位论文 (2) 共变性和杂交:取lOul探针置于杂交区域,盖玻片封片,注 意避免 产生气泡,影响杂交效果,731C共变性5min,37X:杂交9-12h; (3) 洗脱:去除盖玻 片,玻片立即投入洗脱液I中,731C, 2min!再投入 洗 脱液II中,RT, 5-30sec;取出玻片,垂直放入暗室的吸水纸上直至 完 全干燥;将lOul DAPI加于杂交区域,覆盖盖玻片,复染约lOmin; (4) 信号检测:在Nikon 80i秕光显微镜下观察秕 光信号,荣光信号判断 标准:?精子头部核膜完整,边缘清晰,无重 叠;?核内焚光信号清晰, 大小、强弱基本相同,两信号间距至少有 一个信号的距离,位置清楚的存 在于精子头内;?如果两个信号非常 接近,互相有交叉或者两者之间距离 小于信号大小的一半时,判断为 一个信号。观察完后,拍照。 (三> 结果 1. 外周血中期染色体FISH结果 以外周血制备的中期染色体标本,用m a卫星重复序列探针杂交后背景 为蓝色,X染色体着丝粒区为绿色焚光信号,Y染色体着丝粒区为红色焚光信号, 性染色体正常男性有一条X染色体和一条Y染色体,女性则为两条X染色体, 因此在正常中期染色体片上男性为一个红色信号和一个绿色信号,女性为两个 绿色信号。:见图3、图4) 用9、13号染色体位点特异性探针和/或9号染色体a卫星重复序列探针 杂交后背景为蓝色,在青蓝色滤片组下见9号染色体q34为青蓝色,绿色滤片 组下见13号染色体q34为绿色,橙色滤色片组下9号染色体着丝粒区为澄色* 因此在正常中期染色体片上两条9号染色体的着丝粒和长臂末端分别可见一个 澄色和青蓝色焚光信号,在两条13号染色体长臂的末端分别可见一个绿色秕光 信号。:见图6C) 精子FISH结果 2. 焚光显微镜下,利用UV滤色片组可见DAPI复染后精子头部呈蓝色焚光, 边缘清晰。以X、Y探针杂交的精子FISH片中,用绿色滤色片组在精子头部中 可见绿色信号为X精子;用红色滤色片组在精子头部中可见红色 兰州大学硕士研究生学位论文 信号为Y精子。 正常核型的精子应该可见一个红色信号或一个绿色信号,如果精子头部的焚光 信号超过一个,即两个绿色或两个红色或同时有红色和绿色信号时,提示为性 兰州大学硕士研究生学位论文 染色体异常精子<> 应用X/Y双色FISH分析3例正常精液,每张精子标本均计数 2000个精子,其中只有一个红色或一个绿色信号的精子占99.15%-99.35%, X 精子和Y精子比例大致为1:1。性染色体数目异常精子的比例为0.5%,0.27% 的精子没有明显信号•:见图5) 附表2 X/Y双色秕光原位杂交检测正常人精子结果 S号计数精于 X埔子 Y精子 XX精子 YY精子 XY精子 其它 无信号 967 967 5 3 2 2 5 1 2000 _____________________ (48.35%) (48.35%) (0.25?) (Q. 15%) (0.1%) (0.1?) (0.25%) 998 986 3 2 4 0 7 2 2000 _____________________ (49.9%) (49.3%) (0.15%) (0.1%) (0.2%) (0%) (0.35K) 983 1004 3 3 2 1 4 3 2000 _____________________ (49.15%) (50.2%) (0.15%) (0.15%) (0.1%) (0.05K) (0.2%) 2948 3006 11 8 8 3 16 会计 6000 (49.134%) (50.100%) (0.183%) (0,133%) (0. 133%) (0.05%) (0.267%) (四:讨论 生物有机体在长期的发展过程中,与外界环境相互作用的结果形成了一定 的遗传稳定性。作为遗传物质载体的染色体的数目和形态恒定是维持遗传性相 对稳定的必要条件6当染色体发生数目或微小的结构异常,必将引起遗传信息 的改变,导致多种临床症状甚至死亡。目前染色体病己达600多种,在人群中 的发生率达0.5%?1%,我国现有染色体病患者达650万?1300万人,每年有6 万染色体病新生儿出生?就我中心2002年对兰州市464例迪传咨询病人的染 色体分析,染色体异常(不包括染色体多态性)的检出率5.17%^^,其中包括性 染色体异常、倒位、帄衡易位和罗氏易位。这类染色体病患者可有不同程度智 力低下,女性患者还可有闭经、不孕、反复流产、分晚异常新生儿等症状,给 患者和家人带来沉重的生理、心理压力,和沉重的经济负担。因此,染色体异 常患者的检出并预防遗传病患儿的出生对个人、家庭和国家都具有重要意义。 染色体显带技术作为人类细胞遗传学研究和临床细胞遗传学诊断的重要手 段,是染色体病研究和诊断中的一大秕破,但该技术仍存在分辨率相对低,难 以检测出4500"5000kb以下的染色体异常tm,许多复杂的染色体畸变,如标记、 复杂易位、缺失重复、插入等;对于实体瘤、 .27- 兰州大学硕士研究生学位论文 人类配子等细胞无法获得中期分 裂相等问题。PISH技术将传统的细胞遗传学和分子生物学相结合,不但克服了 传统细胞细胞遗传学的局限性,而且具有直观、快速、易于操作等优点,具备 .28- 兰州大学硕士研究生学位论文 更广泛的应用前景。目前常用的探针有特异重复序列探针、特异性单序列 9】探针 和涂染探针|1。特异重复序列探针是针对染色体着丝粒部位存在的a卫星DNA 而的,能杂交到染色体的着丝粒和1、9、16号染色体和Y染色体长臂异染 色质区域,当这类探针用于间期核时又称为染色体计数探针,以检测染色体数 目异常;特异性单序列探针又称位点特异性探针,用于检测染色体数目异常和 传统细胞遗传学技术难以发现的染色体微小缺失、重复,以及鉴定染色体易位 断裂点等:涂染探针包括全染色体涂染探针、臂探针和区带特异性探针,前二 者适合于检测较大区段的结构异常,亚端粒探针是目前最为常用的区带特异性 探针,主要用于蹄查不明原因智力低下患者是否由于亚端粒区段的重复或缺失 引起由于FISH在细胞遗传学的基础上又结合了分子生物学,因此对实验 要求非常高,在探针的制备与标记、样本的制备、样本和探针的变性、原位杂 交和焚光信号检测等一系列操作过程种任何一个小的失误都可能导致杂交失败 甚至得出错误结果。细胞学样本的制备是FISH的第一步,也是至关重要的一 步,如果制片过程中低渗、固定、环境温度和湿度等任何一个条件不合适,都 可能导致染色体不能充分伸展,DAPI复染后染色体成墨团样甚至相互重叠。消 化时间的掌握也非常重要,时间太长可导致DNA降解,无法和探针结合,消化 不够则残留的胞质与探针形成非特异性结合,减弱检测位点的焚光信号强度。 样本和探针变性温度一般控制在73土 11C, 4-5分钟,如果变性温度过高,时间 过长,样本、探针DNA过度解链,形成非特异性结合;变性温度过低,时间过 短,则可能DNA解链不全而信号很弱,甚至没有信号。我室将样本/探针分幵变 性与共变性对比后,认为共变性避免了外界因素和操作者熟练程度的影响,能 得到更好的杂交效果,同时极大的简化了操作流程,节省了时间。另外,准确 的试剂浓度、温度、PH值以及秕光显微镜的优劣等也是影响PISH成功率的因 素之—。 随着辅助生殖技术的发展,ICSI的出现为男性因素不育的治疗带来革命性 的秕破,但使用该技术超越了人类在生殖过程有效的生物学筛选,有可能将携 带染色体畸变、缺失或基因秕变的精子注入卵细胞衆内,从而将各 兰州大学硕士研究生学位论文 2种遗传缺陷 传给下一代t’M。替如,“大Y”在经典遗传学属"正常变异”或“多态性”,陈 胜湘1@等人认为,大Y属于类帄衡易位综合征,可导致女性流产、死产等生育 疾患。我中心仅2006年上半年实施生殖助孕的患者中就有26例为"大Y",检 出率达9.85%,其中9例有不同程度的少弱精。然而外周血染色体反映的变异 或畸变情况并不能完全代表配子染色体的情况。已有研究表明,人精子染色体 畸变率明显高于外周血染色体崎变率而且精子染色体非整倍体与自然流 产、胎儿畴形有关l&???。因此,对男性尤其是需要ICSI治疗的不育患者应当进 行非整倍体精子蹄査,以便更好地对需要ICSI治疗的夫妇进行遗传咨询。炎光 原位杂交技术快速而准确,用于精子的FISH却难度较大,这是由于精子本身的 解剖结构特点,组蛋白逐渐被精子特异性的鱼精蛋白取代,DNA与强碱性蛋白 结合十分牢固,相邻的鱼精蛋白分子间以二硫键相连,染色质被紧密包裹于其 内,故细胞学制备染色体较为困难。因而FISH技术应用于精子的关键就是怎 样打破精子核内二硫化合物桥,并使精子核种胀,增加探针的秔透性,提高杂 交率。目前较为常用的方法是用DTT将精子培养Ih,使其精子头部膨胀后再制 片,此期间因需要反复混匀悬液,并取精子悬液观察精子头部膨胀情况,操作 十分繁杂:而且精子头部膨胀、精子DNA解聚后在离心过程中可能导致精子核 膜破裂,染色质丢失,使精子畸变率和无信号率增加。因此,本研究查阅国内 外文献后,采取常规制备精子样本后,再用5NNaOH对精子标本进行处理, 改变精子核染色质凝集状态,不但简化操作,而且精子头去凝集程度容易控制, 避免染色质丢失,增加结果的可靠性。由于精子数量巨大,其染色体非整倍体 只占很少一部分,所以通常需要计数上千甚至上万条精子才能得到满意的结果。 本研究对3位正常男性精精子进行FISH,总共计数6000个精子,非整倍体率 为0.59&,与文献报道的相似。但是精子染色体自然畸变率在每一个个体中是 否是一个稳定值尚难以定论,因为精子发生过程要60天左右,且相互不同步, 因此对精子核染色体的检査需要动态的观察。 兰州大学硕士研究生学位论文 第三部分应用FISH技术对帄衡易位携带者 进行胚胎植入前遗传学 诊断 (-)病例资料 患者晏某,男,31岁,因其妻自然流产2次后4年未孕来本中心就诊,查 双方外周血染色体发现男方为9号和13号染色体帄衡易位携带者,核型为46, XY, t(9:13)(q22;ql2)。夫妻双方经遗传咨询后要求助孕治疗同时行PGD,并 签署知情同意书。 (二〉方法 1. 控制性超排卵 采用黄体期长方案:GnRH-a /Gn/HCG)进行控制性超排卵:于治疗前月经 周期的黄体中期,给予达菲林1.7mg降调节,降调12天后各项指标提示降调节 达标:血清LH<5IU/L,血清E2<20pg/ral:阴道B超监测卵泡直径<0.5cm,子宫 内膜厚度<0. 5cm),开始注射rhFSH,75IU/日,同时口服补佳乐2mg,2次/日 以滋养内膜;Gnl2天,因卵泡长势欠佳,经讨论后决定加用HMG 75IU/日X4 日,共Gnl6天.Gn 3天后幵始阴道B超监测卵泡发育和子宫内膜增长情况, 隔H—次,同时检测血清性激素;优势卵泡直径达1.4cm时,改为每日监测。 当阴道B超监测1.6?2.3 cm卵泡7-8个时,停止Gn,给予HCG 10000IU肌注, 36h后取卵。取卵术后给予黄体醑eOing和达夫通20ing黄体支持。 2. 卵子采集 HCG注射36h后在阴道B超下行秔刺取卵术,在装置371C恒温热扳的超净 工作台内的解剖显微镜下选卵,同时观察卵子成熟度。 3. 精子准备 至取卵曰男方禁欲5天,常规收集精液,待精液液化后按冊0 (第四版: 标准进行精液分析,精子密度、活力等各项指标均达标,用Puree印tion密度 梯度离心法处理好精液后,置于37^^ 5% C02培养箱鮮育备用。 4. 受精 .30- 兰州大学硕士研究生学位论文 取卵当日患者精液情况达标,结合夫妻双方的临床指征进行病例讨论,并 在患者知情同意后选择以ICSI方式受精。 5. 受精情况和胚胎观察 .31- 兰州大学硕士研究生学位论文 ICSI后16-18h,即胚胎培养第一天:D1)早上观察卵子的受精情况;除了 第一次卵裂,胚胎一般每12h-18h进行一次卵裂,因此受精后39?60h和54? 72h以内依次可见有活力的4细胞期胚胎和8细胞期胚胎,胚胎分裂延迟或过 快一般提示胚胎的活力差,种植潜能低。因此,我室常规于胚胎培养第二天(D2) 和第三天:D3)早上观察胚胎卵裂情况,并根据卵裂球的大小和无核细胞碎片 的有无给胚胎评分,评分标准如下: 1级:卵裂球大小均勾,形状规则,透明带完整;胞质均勾,清晰;胚胎无或 有少量:<590碎片; 2级:卵裂球大小略不均勾,形状略不规则,透明带完整;胞质有颗粒现象; 碎片达10%-20%; 3级:卵裂球大小明显不均匀,可有明显的形状不规则,透明带完整:胞质有 明显颗粒现象;碎片达21%-50%: 4级:细胞大小严重不均勾:胞质有严重颗粒现象;碎片超过50%? 6.胚胎活检、卵裂球固定 胚胎培养第三天根据胚胎卵裂球数量和评分情况,病例讨论后决定每个胚 胎活检卵裂球数量,一个胚胎内最多活检2个卵裂球。全部胚胎活检完后将活 检后的胚胎转入囊胚培养基,置于37t:, 5% CO2培养箱继续培养48h;卵裂球 立即固定,每张玻片固定1-2个来源于同一胚胎的卵裂球,具体操作参见第一 7. 卵裂球PISH和结果分析 采用CEP9、LSI9、LSI 13三种探针组合,对活检的卵裂球进行FISH诊断。 8, 胚胎移植 胚胎培养第5天,将2-3个无发病危险的胚胎在腹部B超引导下行胚胎移 植术;其它无发病危险的胚胎予以冷冻保存,而遗传学诊断为异常的胚胎经医 学处理后丢弃。 (三:结果 兰州大学硕士研究生学位论文 取卵当曰获取卵子10枚,均为Mil卵,病例讨论后行ICSI,显微注射过 程中见卵母细胞弹性欠佳,受精后18h观察正常受精7枚,胚胎培养第二天、 第三天观察大部分胚胎发育偏慢,第三天时仅1枚为8 -6细 细胞期,其余为2 胞期,讨论后决定暂活检3枚,8细胞期胚胎活检2个卵裂球,6细胞期和4细 胞期胚胎各活检1个卵裂球,活检完后所有胚胎转囊胚培养 基继续培养• 4个卵裂球分别固定在3张载玻片上,杂交过夜、洗脱后荣光显微镜下观 察,3枚胚胎均为非帄衡易位胚胎;观察其它7枚胚胎,其中3枚胚胎停育,4 枚胚胎有继续卵裂现象,质量可,经讨论活检5枚胚胎,每枚胚胎活检1个卵 裂球。杂交洗脱后秕光显微镜下观察3枚胚胎内均可见2个撥色、绿色、青蓝 色秕光信号,判断为9、13号染色体正常或帄衡易位携带:1枚胚胎为非帄衡 易位;1枚胚胎红色、绿色、青蓝色各显示一个信号,可能是孤雎激活。 因此,在胚胎培养第三天、第四天共活检胚胎8枚,卵裂球9个,顺利固 (•。经FISH检測,3枚为9、13号染色体正常或帄衡易位 ,,于胚胎培养第5天在腹部B超引导下行胜胎移植术;4枚为非帄衡 易位胚胎,1枚孤唯激活胚胎和2枚停育胚胎经医学处理后丢弃,无可冷冻胚 胎。附表3为患者胚胎发育,活检和FISH检測结果。:见图6) (四: 讨论 随着超声影像学、细胞培养和显微技术的发展,我们已经能获取人类的生 殖细胞,并在体外进行培养,治疗各种生理性或病理性的不孕不育,实现人类 生殖的自我调控。而在辅助生殖技术和分子遗传学基础上发展的起来的胚胎植 入前遗传学珍断:PGD)技术,使人们能够对植入前的早期胚胎进行遗传学检测, 从而筛选出正常胚胎进行宫腔内移植,为控制遗传病患儿的出生、降低遗传病 率以及探讨出生缺陷等的发病机制提供了新的途径。据统计甘肃省2003 年-2013年总人口年均增长将达20万人左右,其中每年的出生缺陷约6000人, 出生缺陷发 兰州大学硕士研究生学位论文 生率达16.4%),每年将导致6万左右的新增贫困人口。由此可见, 改进遗传学诊断技术,幵展包括PGD在内的遗传咨询和遗传病筛査,预防遗传 病患儿的出生对我省优生优育、提髙出生人口素质具有重要意义。 染色体易位是最常见的染色体结构异常性遗传病,是发生在2条染色体之 间的涉及2个或2个以上的断裂和变位重接。因为这种变化只有染色体结构的 变化,而没有遗传物质的丢失和增加,所以易位携带者自身没有任何临床症状。 而他们的后代可出现三种情况:?染色体核型正常,表型正常;?染色体核型 不正常,表型正常:帄衡易位携带者);?染色体核型不正常,表型不正常:不 帄衡易位,有遗传物质增减)》染色体易位包括罗氏易位和相互易位,罗氏易位 在两个端着丝粒染色体之间:13-15和21、22号染色体:发生,如果发生在同 源染色体之间,不能形成正常配子,即使妊娠也都会因自发流产而终止:而非 同源的罗氏易位可形成6种类型的配子:丨种正常,1种为帄衡易位,其它4种 有某一条染色体缺失或重复。而相互易位相对更为复杂,根据减数分裂时分离 方式的不同产生至少18种配子,除了 1个正常和帄衡易位配子,其余16种均 为不帄衡配子。它们和IE常紀子结合后,形成正常、携带者、部分三体或部分 单体三种类型的合子。由于目前无法对配子和植入前胚胎进行显带,因此还无 法检测其易位分离的方式,以及从总体上了解全部染色体是否正常。利用FISH 对易位携带者的胚胎进行植入前诊断的原理就是依据nsH信号的数目及其 几何学近似性,利用不同的秕光染料,毎一种代表一段特异性的和不同染色体 特异性的_序列,就可在间期细胞中判断易位染色体的存在与否,并通过记 录信号的总数及其向光近似性来推测染色体的不帄衡状态《据此,选取相应的 两条染色体长臂的位点特异性探针,用不同颜色标记,就可区分罗氏易位三种 不同类型的胚胎;而对于相互易位,可以用相应易位染色体的亚端粒探针结合 一条染色体的着丝粒探计或者用跨断裂位点探针进行检測。跨断裂点探针分别 用4种不同颜色分 兰州大学硕士研究生学位论文 别标记两个断点的两侧P?"?J,具有高度准确性但非常昂贵, 同时易位可以发生在任何两条染色体之间,断裂也可以发生在染色体的任何部 位,因而相互易位的类型很多,而每种易位也可能是唯一的,所以此类探针目 前较难获得《鉴于染色体易位总是涉及易位染色体的末端,而且染色体末端位 点特异性探针较亚端粒探针片断更大,具有更强的荣光信号,因此本研究用9、 13号染色体长臂末端位点特异性探针(LSI9, LSI13)代替亚端粒探针,结合9 号染色体着丝粒探针(CEP9)对一例9、13号染色体帄衡易位携带者进行PGD获得3枚可移植胚胎。, 但目前在临床常规开展PGD仍存在一些困难:?西部地区人们的思想较我 国东部地区人们的思想更为保守,受宗教和伦理观念的影响,同意将胚胎捐赠 用于科研的数量十分有堪,符合一定标准的就更少:?从理论上估计,经减数 分裂后形成正常配子的几率很低【"“丨,很可能最后无可移植胚胎,增加患者的心 理和经济负担;?目前的冷冻方案不适宜活检后胚胎的冻存,尚无法为患者提 供良好的生育保险;?FISH的探针十分昂贵,一种探针只能检测排除一种异常, 而且只能用特异的探针检测已知的染色体异常,因此FISH目前不能筛查出所 有的染色体异常,并大大增加患者的医疗费用;?目前FISH仅限于染色体病检 测,不适用于单基因病。因此,目前若要在西部地区开展PGD,发挥其在遗传 优生中的巨大作用,除了需要幵发更多可用的探针,关 接受的价格。 键在于使其具有患者能 综上所述,应用FISH对具有遗传风险的患者的植入前胚胎进行遗传学分 析,在预防染色体病患者出生中有重要的临床价值,而且有助于了解减数分裂 染色体紀对、重组的机制。此次对具有染色体异常的患者在进行辅助生殖的同 时,应用FISH对植入前胚胎进行遗传学诊断在甘肃省乃至西北地区尚属首例, 标志着我中心的遗传诊断技术登上了一个新台阶。此技术的应用有利于提高辅 助生殖妊娠率,同时降低自然流产率和出生缺陷率,对于西北地区提高出生人 口素质、贯彻优 .34- 兰州大学硕士研究生学位论文 生优育政策具有重要意义:对于人类生殖遗传学和遗传优生学 的发展 也将发挥重大作用* 结论 根据欧洲人类生殖与胚胎学会2006年发布的数据,全世羿有70多 个辅助 生殖中心开展PGD,我国有3个中心幵展了这方面工作,西北 地区在该领域的 研究尚处空白《因此,本研究在中心成熟、稳定的辅 助生殖技术和细胞遗传学 技术的基础上,建立一套对体外受精获得的 胚胎卵裂球进行焚光原位杂交为基 础的分子细胞遗传学技术帄台具有 重要意义。对有遗传风险的不孕夫妇在辅助 生殖助孕同时进行PGD, 为阐明人类早期胚胎的发育及染色体异常形成机制提 供了良好机会, 对人类优生也具有重要价值。 参考文献 1. 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