通脉大生片对卵巢功能低下大鼠卵巢激素与血供的影响

通脉大生片对卵巢功能低下大鼠卵巢激素与血供的影响 ,,, 第十次全国中医妇科学术大会论文集 ,,,,(,,哈尔滨?实验研究? 通脉大生片对卵巢功能低下大鼠 卵巢激素与血供的影响 昊克明，付雨。徐晓娟，全崇毅 (成都中医药大学，四川成都,,,,,,) 〔摘要】目的建造稳定可靠的雷公藤多苷致大鼠卵泡发育障碍模型，现察补肾法中药复方干预性治疗的作用 机理。选雌性育龄期,,大鼠动情期正常者为受试动物。随机选取,只为正常组，其余大鼠参照前期研究方法 予雷公藤多苷,,,,,,,,,灌胃造模。选取雷公藤模型大鼠,,只。随机分为空白组、倍美力组、中药高剂量组、中药中 剂量组、中药低剂量组,组(分别予倍芙力和通脉大生片不同剂量治疗,天，正常组同期给予等量生理盐水。各组 均于治疗前采血。治疗后采血并处死动物，称重法测算卵巢指数;放射免疫法检测血清雌二醇、孕酮;酶联免疫吸附 法检测抑制素,水平;免疫组化法检洲卵巢雌激素受体、孕酮受体、内皮抑制素、血管内皮生长因子及其受体等; ,,染色光镜下卵巢血管形态的改变。结果(,予雷公藤多苷,,,,，,;,,,连续灌胃,,周，可造成育龄期大鼠动 情周期紊乱或消失。卵巢指数下降。卵巢中生长卵泡数量明显减少。血中,,、,,、，,,,水平明显降低;卵巢组织中 ,,表达明显降低;卵巢血管生成抑制因子,,,,,,,,,,表达显著升高，,,,,表达显著降低;卵巢血管横截面积变小 而血管壁厚度面积比增大。(彩运用通脉大生片干预性治疗后，大鼠动情周期恢复至正常范围，卵巢指数升高;血清 ,,、,,、，,,,水平明显升高:卵巢血管中,,,,,,,,,,表达明显降低。,,,,表迭明显升高;卵巢血管横截面积增大 而血管壁厚度面积比减小(与空白组相比均有显著性统计学意义。结论雷公藤多苷可造成大鼠卵泡发育障碍和卵 巢功能低下。补肾气益精血的中药复方”通脉大生片”能显著提高模型大鼠的抑制素,和雌激素水平及其受体表 达。调节卵巢血管生成抑制因子,,,,,,,,,,争血管表皮生长因子,,,,及其受体，卵巢血管横截面积加大而血管壁 厚度减小。从而增加卵巢局部血供。有效地促进卵泡发育和提高卵巢功能。 〔关键词】雷公藤多苷;通脉大生片;卵巢功能低下;动物模型;雌激素及其受体;抑制素,;血管生成抑制因 子:血管内皮生长因子及其受体 卵泡发育障碍可造成卵巢分泌的雌激素水平下 医药大学动物实验中心提供，合格证号为川实动管降、生殖功能低下，临床上可表现为月经过少、经期 质第,号。缩短、月经后期稀发、甚至闭经和卵巢早衰、不孕等， ,(,(,实验药品:?雷公藤多苷片由黄石飞云制药并常伴随出现一系列生理、心理症状。如情绪低落、 有限公司生产，批准文号为国药准字心情烦躁、潮热汗出等，严重影响了妇女生殖健康。 ,,,,,,,,,，,,,,,片。?倍美力(结合雌激素片)由爱本文参照前期自主研究雷公藤小鼠模型的造模方法 尔兰惠氏药厂生产。进口药品注册证号:建立雷公藤多苷致大鼠卵泡发育障碍和卵巢功能低 ,,,,,,,,,,。分包装批准文号:国药准字下模型【?。观察补肾气益精血的临床验方“通脉大生 ,,,,,,,,,，规格:,(,,,,,。?通脉大生片:,(,‖片，片”对模型大鼠血清生殖激素及其受体与卵巢血管 成都中医药大学附属医院药荆科提供。血供因素的影响(在探索中药复方药理作用机理的 ,(,(,实验试剂:?,,、,试剂盒:天津九鼎医学生同时论证该模型病证结合的中医证候属性。 物工程有限公司。国药准字号,,,,,,,,,、 ,,,,,,,,,。?抑制素,试剂盒:大连泛邦生物技术,材料与方法 有限公司(产品编号,,,,一,,,,,,,,,,,,,，，,,,,。,(,实验 材料 ?,,、,,免疫组化试剂盒:武汉博士德生物工程有,(,(，实验动物:健康雌性,,大鼠,,只，,,周龄， 限公司。?,,,,和,,,—,、兔抗大鼠,,,,抗体为体重,,,—,,,,，均为清洁动物，检疫合格。由成都中 一抗，稀释度，:,,,;二抗及检测试剂盒为,,,,工 ,,,,(,,哈尔滨 ,,, 第十次全国中医妇科学术大会论文集作液(美国,,,,,,,,,,公司)，武汉博士德生物工程 指数,卵巢(子宫)湿重(,,,),体重(,),,,,,。?血清有限公司。(耋),,,,,,,,,,免疫组化试剂盒:武汉博士 ,,、,含量:采用叮放射免疫分析法测定。?，,,,德生物工程有限公司(以上二抗及相应试剂盒均购 含量:股动脉取血，常规分离出血清，采用酶联免疫自北京中科生物技术有限公司)。?,,,显示剂: 吸附法(,,，,,)检测;检测范围,一,,,,,,,，线性范,,,一,,,,福州迈新技术有限公司。 围,(,,,,,,,,,，批内差异,,,。批间差异,,,,。?,(,(,实验仪器:?,,一,,,,，,放射免疫自动分析 ,,、,,、,,,,及其受体,,,—,、 ,;一,,,酶标仪:深圳 标均,,检测:以上指仪:科大创新股份有限公司。? 采用免疫组化,,法检测。以切片中出现的棕黄市凯特生物医疗电子科技有限公司。?病理检测仪 色反应为阳性。无棕黄色反应者为阴性。每例动物随器:,,,—,型全自动封闭式组织脱水机、,,,—,,型 机选取,张切片。在光学显微镜下，所有切片均在同包埋机、切片机(,,，,,一,,,,，德国)、,,,—,,，型病 一光强度下、同一放大倍数(,,,,,)下每张切片随机理组织漂烘仪(常州市中威医疗仪器有限公司)、 选择,个视野照相(采用,,,,一,,,,图像分析系统,,,,病理摄像系统(四川大学图形图像研究所)。 进行分析。指标选取阳性面积、平均光密度、阳性面,(,实验方法 积率、积分光密度。?卵巢组织学观察及卵泡与黄体,(,(,动物造模:分笼适应性喂养,,后。对实验大鼠 计数:将大鼠断颈处死，剖腹取右侧卵巢，置于中性行阴道脱落细胞学涂片。筛选出动情周期正常者为 福尔马林液中固定，石蜡包埋，常规切片，,,染色，受试动物。随机取出,只为正常对照组。其余大鼠参 光镜下观察大鼠卵巢组织形态学变化、计数生长卵照张氏法〔,,予雷公藤多苷片,,,,,,,,,灌胃，连续,, 泡数目、黄体数目、卵巢血管数目等。周造模。 ,(,(,数据处理方法:所有数据均采用,,,,,,(,统计,(,(,分组给药:将动情周期消失、造模成功的大鼠 软件进行处理(计量资料多组问用,,,,,,,,,只随机分为,组，每组,只，分别为空白组、倍美 ,,,,,方差分析。组间比较采用,,,、,—,—,分析力组、中药高、中、低剂量组，加上正常组，共,组。空 和,,,,,,,’, ,,检验。方差不齐者用非参数检验的白组:每日以,,,,,,,,生理盐水灌胃。倍美力组:按 ,,,,,,,,,,,,—,检验，各组数据均以(】口,,,)表示。成人公斤体重的临床用药剂量以人鼠比例换算后 ,实验结果,,倍(,(,,,,,,)的西药倍美力灌胃，每,, ,次，连续,天。中药高中低剂量组:分别按成人公斤体重的临 ,(,阴道脱落细胞涂片:大鼠正常性周期一般为,—,床用药剂量以人鼠比例换算后,,、,,和,倍(,(,,, 天。包括动情前期、动情期、动情后期和动情间期。造,,、,(,班,、,(,,,,,)的通脉大生片灌胃，每日,次， 模,,周后，大鼠动情周期紊乱，表现为持续的动情连续,天。正常组正常喂养，不灌胃。 间期而无动情期，这说明雷公藤多苷使大鼠 卵巢内,(,(,检测指标:?卵巢与子宫指数:所有动物均选 分泌功能受到明显抑制。用药,天后，中药高剂量组择在非动情期处死，小心取出完整卵巢和子宫，去掉 基本趋于正常，中药中、低剂量组周期延长至,,,筋膜及脂肪组织，电子天平称重，将称得的卵巢和子 天。倍美力组则延长至,,,天。宫湿重分别除以体重，按以下公式计算:卵巢(子宫) ,(,给药后各组大鼠卵巢指数、血清,,、,、，,,,水平 衰,各组大鼠卵巢指数、血清,,、,、，,,,比较(爻?,) 注:,(与正常组比较。,,,,(,,;,(与空白组比较，,,,,,(,, ,,, ,,,,(,,哈尔滨 第十次全国中医妇科学术大会论文集,(,给药后各组大鼠卵巢组织,,、,,积分光密度 结果显示:雷公藤多苷大鼠模型血清雌二醇(,,)水 表, 卵巢组织,,、,,积分光密度比较(涵) 平显著降低，孕酮(,)水平有降低趋势，通脉大生片 治疗后，血清,,水平明显升高、,水平呈现上升趋 势，说明通脉大生片能使肾精充、肾气旺、气血足、冲 任滋，促进雷公藤多苷模型大鼠的卵泡发育，提高卵 巢性激素水平，使受损的卵巢功能明显改善。 ,(,通脉大生片对大鼠血清抑制素,的影响:抑制,(,给药后各组大鼠卵巢血管,,,,,,,,,,、,,,,及 索,(,,,,,,, ,。，,,,)是转化生长因子,超家族的受体,,,一,积分光密度 成员，由卵巢窦卵泡中颗粒细胞分泌，，,,,作用于塞塑巢血笸旦,,,,,,,,，,,,,及受体,，,,,积分光密度比较,五 垂体，对卵泡刺激素(,,,)有负反馈调节，其机理是 通过改变雌激素(,,)底物的量而调节,,的产生，影 响卵子发育、成熟、排卵各环节。,,,,,,,,等【,研究表 明，卵巢功能衰退时血浆，,,,和，,,,水平均降 低，故，,,可以早期预测卵巢功能衰退，比,,,更 注:,(与正常组比较，,,,,(,,，?,,,,(,,;,与空白组比较。”,,,,(,, 敏感。,,,,,,等〔,,研究发现。，,,,分泌水平的上升 与卵巢颗粒细胞功能恢复呈正相关。推测，,,,可,(,各组大鼠卵巢血管横截面积和血管壁厚度面积比 作为评估卵泡发育或预测卵母细胞恢复数目的标志 表,各组大鼠卵巢血管横截面积和血管壁厚度面积比的比较,,,) 物。本实验结果显示，倍美力和通脉大生片不同剂量 治疗后均可升高雷公藤多苷模型大鼠的，,,,水 平，从而改善卵巢储备功能。 ,(,通脉大生片对大鼠卵巢雌孕激素受体(,,、 ,,)的影响:本实验结果显示，雷公藤多苷模型大鼠 注:,(与正常组比较，,,,,(,,;,(与空白组比较，?,’(,(,, 卵巢,,表达降低，,,表达无明显变化，提示雷公 藤多苷可能是通过影响卵巢中,,的表达。降低了 雌激素在卵巢组织的生物学效应(造成卵巢功能低,讨论 下。中医学所说“肾”的含义(包括了生殖系统和与此,(,通脉大生片的组成和功能主治:通脉大生片是 有关的内分泌功能(通脉大生片正是通过改善肾中根据已故妇科名老中医卓雨农先生的经验方经现代 精气的亏损与不足，提高卵巢中性激素受体含量，增工艺研制而成的我校附属医院院内制剂〔,,，该方由菟 强雌激素效应，达到预期的治疗效果。丝子、肉苁蓉、杜仲、何首乌、乌药、车前子、山药、茯 ,(,通脉大生片对大鼠卵巢血管,,,,及其受体苓、当归、枸杞、续断、桑寄生、紫河车、鹿角霜、艾叶、 ,,,一,的影响:器官的血液灌注与其功能相适应(砂仁、荔枝核等组成，方中菟丝子、肉苁蓉、杜仲、续 卵巢是血管生成最活跃的器官。卵巢血流是维持断、桑寄生、紫河车补益肾精，鼓舞肾气;枸杞子、何 卵泡的生长、类固醇激素的分泌以及卵泡对促 性首乌、当归养血益肝，调养冲任;山药、砂仁健脾和 腺激素敏感性的重要因素。若血管血流变慢。耗氧胃;鹿角霜、艾叶、乌药、荔枝核温经理气;茯苓、车前 量下降，卵巢微循环障碍，可致卵巢缺血缺氧，加子利水渗湿引诸药下行。全方补肾为主，肾、肝、脾三 速卵巢细胞凋亡及卵泡闭锁，使卵巢机能衰退〔,,。脏同治。共奏补肾气益精血之功，在临床使用了近 卵巢血管生成的调节涉及嘀盅芑钚晕镏屎脱担澳辍,惴河糜谥瘟坡殉补δ艿拖吕嗖??缭戮管生成因子,，研究表明，在卵巢、子宫内膜等部位期、量少、闭经和不孕症等属肾精气亏虚证者，疗效 有丰富的,,,,及其受体的表达。,,,,作为血管卓越。 内皮细胞特异性有丝分裂原(是一种极强的血管,(,通脉大生片对大鼠血清,,、,值的影响:本实验 生成促进剂。具有促进内皮细胞分化、增生、迁移、 ,,,,(,,哈尔滨 第十次全国中医妇科学术大会论文集 ,,,浸润(调控血管发生和维持血管内皮细胞功能的 量(,,,,,,,,,,对血管的抑制作用是通过竞争性抑作用，能通过旁分泌和自分泌方式促卵巢血管周 制,,,,与其受体,,,一,结合来实现的。实验还发期性生长和形成，改善卵泡的血供，保证和增加 现(在免疫组化切片上,,,,,,,,,,的表达呈明显异氧、促性腺激素、生长因子、类固醇激素前体和其 质性(即强阳性染色的,,,,,,,,,,细胞经常出现于他促卵泡生长物质的供应，促使卵泡发育，故认为 血管边缘及坏死周边区(而促血管生成的生长因卵泡液中,,,,浓度可作为卵母细胞成熟的生化 子,,,,也经常在这些区域出现强的表达，这可能标志之一疆棚。,,,,只有和特异性受体结合后才能 反映了,,,,,,,,,,对上述血管生成因子负调节机发挥其生物学功能，目前已有两种,,,,受体被鉴 制的存在。定和克隆，即,,,,受体，(,,,,,一,，又称,，,—,) 雷公藤多苷通过下调血管生成因子,,,,的表和,,,,受体,(,,,,,,，又称,,,,,一,或 达，上调血管生成抑制因子,,,,,,,,,,的表达，打破,,,)。均属,类酪氨酸激酶受体(而以,，,—,与 了血管生成平衡。导致卵巢血供异常，影响卵巢正常,,,,的关系更为密切。涉及趋化性并有调节血管 功能。通脉大生片高剂量组可使,,,,,,,,,,表达降通透性的作用。 低，与空白组相比，差异具有统计学意义(,,,(,,)。 本实验结果表明:雷公藤多苷模型大鼠卵巢血 我们推测:通脉大生片通过补肾益精血。下调血管生管,,,,及其受体,,,一,表达明显下降，光镜下见 成抑制因子,,表达、上调血管生成促进因子,,,,卵巢血管壁变厚，管腔变窄，使卵泡发育和血管生成 及其受体,,,—,的表达，使精血充盛，改善了卵巢功受损，通脉大生片能够上调,,,,及其受体,,,一, 能。这正是中医“血”、“脉”理论的实验验证。的表达，促进卵巢血管形成。使卵巢血管壁变薄，管 ,结论腔扩大，减少血流阻力，明显改善卵巢局部缺血、缺氧状况，为卵泡正常发育提供了必要的物质基础，使 ,(,雷公藤多苷,,,,,,,,,连续灌胃,,周，可造成“垂死”卵泡复苏，从而提高卵巢功能。 大鼠卵泡发育障碍和卵巢功能低下之病理状态，表,(,通脉大生片对大鼠卵巢血管内皮抑制素(,,— 现为:动物卵巢指数减轻，动情周期紊乱或消失;大,,,,,,,,，,,)的影响:,,,,,,,,,,是从鼠内皮细胞 鼠血清,,、抑制素,水平明显降低，卵巢组织中瘤血管的培养上清中分离纯化出的一种蛋白质。 ,,表达明显降低:卵巢血管中,,,,表达显著降由,,,个氨基酸组成，分子量为,,,,,,埘。人和鼠 低，其受体,,,一,表 达有下降趋势，而血管生成抑制的,,,,,,,,,序列,,,一致。相似处,,,,。有很 因子,,,,,,,,,,表达显著升高，且卵巢血管壁变厚，高的结构共性。,,是目前已知最有效的血管形成 管腔变窄，从而使卵巢血供减少。抑制因子，能强烈抑制血管内皮细胞增生，有效抑 ,(,补肾气益精血的通脉大生片能够提高雷公藤制新血管的生成。研究表明,,可以影响内皮细胞 多苷模型大鼠的卵巢功能，表现为:经通脉大生片治中参与血管生成调控的多条信号通路，包括,,,, 疗后，动物卵巢指数增加，动情周期基本恢复正常;及,,,,诱导的信号传导通路,,,。本实验结果表 血中,,和抑制素,水平明显升高:卵巢中,,和卵明:模型空白组大鼠卵巢血管中,,,,,,,,,,表达显 巢血管中,,,,表达均显著升高，而血管生成抑制著升高，与正常组相比，差异有统计学意义(,, 因子,,,,,,,,,,表达显著降低:卵巢血管横截面积,(,,)，结合上述,,,,及其受体,,,—,的检测结 增大而血管壁厚度减小，提示通脉大生片可促进卵果，提示,,,,,,,,,,竞争性阻断,,,,诱导血管生 巢血管生成，增加卵巢血供，激发卵巢潜能。成的信号传导通路，减少血管内皮细胞膜,,,,数.