弱精子症精子线粒体DNA A3 243G，G3 316A和T3 394C突变的检测_24056

弱精子症精子线粒体DNA A3 243G，G3 316A和T3 394C突变的检测_24056 弱精子症精子线粒体DNA A3 243G，G3 316A和T3 394C突变的检测 [标签:来源] 作者:凌雪梅 方可欣，楼哲丰，张巍，张李雅，金龙金 【摘要】 目的:检测弱精子症精子线粒体tRNAleu 3 243位点、线粒体ND1 3 316位 点和3 394位点碱基突变频率，分析三个位点突变与弱精子症的相关性。方法 :按WHO标准 随机收集了69例弱精子症患者精子标本和60例正常人正常活动力精子标本，以聚合酶链反 应、Apa?和Hae?限制性内切酶长度多态性分析和测序检测mtDNA A3 243G、G3 316A和T3 394C 三个位点的突变，比较两组突变频率的差异。分析G3 316A和T3 394C突变的氨基酸变异情 况并结合生物信息学工具分析错义突变氨基酸进化保守性。结果:弱精子症精子mtDNA G3 316A突变率(4.35%)、T3 394C突变率(2.90%)和总突变率(7.25%)与正常对照组(分别 为5.00%、1.67%和6.67%)比较，差异无显著性。氨基酸变异分析发现，G3 316A(Ala->Thr)、 T3 394C(Tyr->His)均为错义突变，其中T3 394C突变位点所编码的氨基酸在人、牛、小鼠、 爪蟾4种生物中进化具有高度保守性。结论:G3 316A和T3 394C突变可能不是影响人类精 子活动力的主要因素。 【关键词】 弱精子症 mtDNA 突变 Abstract: Objective: To detect the mutation frequencies at the locis of mtDNA 3 243，3316 and 3 394 in sperms and asthenospermia， to analyze the correlationship between the mutation asthenospermia at three loci. Methods: After 69 asthenospermia cases and 60 control cases were collected under the WHO criterion，the point mutations of mtDNA 3 243，3316 and 3 394 in sperms was detected using PCR-RFLP (polymerase chain reaction and restriction endonuclease fragment length polymorphism) with Apa?and Hae? and sequencing. Mutation rate of asthenospermia group were compared to control group. The amino acids evolution conservation of the missense mutation sites were also analyzed by bioinformatics tools. Results :The results of mutation frenquency (G3 316A 4.35%，T3 394C 2.90%，total 7.25%) in asthenospermia group showed no significant differences compared with control group (5%，1.67% and 6.67%). G3 316A (Ala-Thr)and T3 394C (Tyr-His) were missence mutations(Of whem，the amino acid of the nt3 394 sites was highly conserved in four species that have different evolution levels(Conclusion: These mutations of G3 316A and T3 394C in human sperm may be not enough to induce the decreasing of the motality of sperm. Key words: asthenospermia;mtDNA;mutation 按WHO推荐，夫妇同居1年以上，未采用任何避孕措施，由于男方原因造成的女方不孕者，称为男性不育。据WHO统计，大约有10%,15%的已婚夫妇不育，且男方不育因素约占50%[1]。在男性不育症中，部分现为精子活动力低下(a级精子<25%且a+b级精子<50%)，称为弱精子症[2]。精子运动需要能量供应，已知线粒体是细胞的能量代谢中心，但线粒体在弱精子症发生中的作用还不精楚。nt3 243位点位于tRNAleu(UUR)基因，Spiropoulos[3]等对一名有线粒体A3 243G突变男性精子进行分析，认为突变的程度和精子活动力降低关系密切。但是Huang等[4]指出一些携带A3 243G突变者也可有正常的精子活动力。nt3 316和nt3 394位于mtND1基因，季敬璋等[5]对2型糖尿病患者G3 316A和T3 394C突变进行检测，前者与对照组比差异具有显著性而后者差异无显著性;但G3 316A和T3 394C突变与弱精子症的关系尚鲜见报道。为了探索弱精子症与mtDNA突变的相关性，进而探讨弱精子症的分子病因，我们对弱精子症mtDNA A3 243G、G3 316A和T3 394C突变进行了检测。 1 材料和方法 1.1 研究对象 弱精子症精液标本来自本校附属第一医院生殖医学中心，按照WHO精液参数标准，选取精子活力低下(a<25%且a+b<50%)者69例，精子活动力正常组60例。所有标本采集前禁欲3 d以上，手淫法采集标本，于37 ?C液化20,30 min。 1.2 主要试剂 PCR扩增引物依据文献[5]设计，上游引物序列:5’-TTCACAAAGCGCCTTCCCCC-3’，下游引物序列:5’-GCGATGGTGAGAGCTAAGGTC-3’，扩增nt3 153,3 551区域399 bp。引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。限制性内切酶Hae III、Apa I为Fermentas公司产品。PCR反应试剂盒、DNA片断纯化试剂盒为宝生物工程(大连)有限公司产品。 1.3 方法 1.3.1 精子mtDNA提取:精液液化标本用PBS洗涤2,3次，沉淀加200,500 μL消化液(200 mmol/L Tris-HCl，400 mg/L蛋白酶K，15 μmol/L DTT，0.1% SDS，1 mmol/L EDTA)，于56 ?C消化过夜，酚-氯仿抽提，乙醇沉淀。 1.3.2 PCR反应和产物鉴定:2.5 μL DNA模板，上游引物和下游引物(10 μmol/L)各0.3μL，2.5μL dNTP(2.5 mmol/L)，1.5 μL 25 mmol/L MgCl2，2.5 μL 10×PCR缓冲液，0.1 μL Taq酶，补充dd H2O至25 μL。反应体系在94 ?C预变性5 min，按94 ?C变性30 s，58 ?C退火30 s，72 ?C延伸1 min程序共循环35次，最后于72 ?C终末延伸7 min，扩增产物用1.6%琼脂糖电泳鉴定。 1.3.3 PCR产物的纯化和限制性内切酶酶切:按宝生物工程(大连)有限公司DNA片断纯化试剂盒说明书操作纯化PCR产物，纯化后的PCR产物分别用Hae III、Apa I两种限制性内切酶消化，消化反应体系和反应条件按说明书操作，消化后的产物用0.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染，数码照相。 1.3.4 序列测定:经PCR-PFLP筛查出有突变的标本，PCR产物经纯化后送上海基康生物技术有限公司进行正向测序。 1.4 数据分析 1.4.1 序列比对:测序返回结果用Gentle软件与Mitomap数据库(www.mitomap.org)上提供的人类线粒体剑桥序列进行比对，发现可疑的变异位点后用ChormasPro软件读取测序结果峰图进一步确认。 1.4.2 突变位点的氨基酸变异分析:对筛查到的2个突变位点在Mitomap数据库中查找相应氨基酸改变情况，并分析突变位点的氨基酸进化保守性。 1.5 统计学处理方法 组间突变率的比较采用卡方检验。 2 结果 2.1 PCR扩增结果 69例弱精子症和60例正常对照精子DNA标本全部扩增出特异性条带。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳显示与预期产物片段大小一致(见图1)。 2.2 PCR-RFLP和测序检测突变结果 将PCR产物分别用Hae III、Apa I酶切消化后，非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，突变标本经测序证实，共检测出G3 316A和T3 394C两种突变(见表1，图2、3)，G3 316A、T3 394C和合计突变率在两组间比较差异无显著性。两组标本未检测到A3 243G突变。 2.3 G3 316A，T3 394C突变的氨基酸变异和进化保守性分析 G3 316A，T3 394C突变均为错义突变，突变前后氨基酸改变和突变位点的氨基酸进化保守性(见表2)分析显示nt 3 394位点所编码的氨基酸在所分析的人、牛、小鼠和爪蟾4种生物中具有高度进化保守性。 3 讨论 精子的运动功能或运动能力的强弱直接关系到能否受精，只有一定数量的快速前向运动的精子才能确保精子抵达输卵管壶腹部与卵子结合成受精卵。ATP是精子活力的重要能源，获能后的精子通过氧化磷酸化产生大量ATP，精子出现一种特异的“鞭打样”运动方式，通过此种方式，精子穿过卵子透明带而受精。如果精子能量代谢障碍，精子就可能产生活力降低和受精能力的下降，产生生殖障碍。Holyoake等[6]发现2个最常见的线粒体基因位点9055和11719在低活动力精子中突变率显著提高，与精子活动力相关。我们对弱精症mtATPase6基因突变研究显示，mtATPase6具有进化保守性位点的累计错义突变频率显著高于对照组，认为这些位点突变可能与弱精子症有关[7]。但是，国内外对弱精子症的线粒体基因突变研究尚少见，还没有明确的证据证明哪些突变是导致精子活动力下降的原因。ND1基因表达的蛋白质是组成线粒体呼吸链和氧化磷酸化代谢酶复合体?的一个亚单位，即NADH脱氢酶单位1，该蛋白是线粒体DNA编码的13个蛋白质亚单位之一。nt3 316位于mtND1蛋白的N端第4个氨基酸，正常情况下该密码子编码丙氨酸，G3 316A突变可导致ND1亚单位上第4位疏水性氨基酸丙氨酸变成亲水性氨基酸苏氨酸。nt3 394位于mtND1蛋白的N端第30个氨基酸，正常情况下该密码子编码酪氨酸，T3 394C突变使亲水性的中性氨基酸酪氨酸变为亲水性的碱性氨基酸组氨酸。有研究报道，这2个位点突变与2型糖尿病相关[8]。氨基酸保守性分析显 示，nt3 394位点编码的氨基酸在人、小鼠、牛、爪蟾4种生物中具有高度进化保守性，且 nt3 316和nt3 394突变均位于ND1的保守区。刘松梅等[8]认为，nt3 316和nt3 394这2 个位点的突变引起疏水性氨基酸到亲水性氨基酸和中性氨基酸到碱性氨基酸的改变，使NADH 脱氢酶亚单位1的二级结构发生改变，导致了线粒体氧化磷酸化的损伤。但在我们检测出有 突变的9例标本中有4例具有正常活动力的精子，弱精子症组和正常对照组突变率差异无显 著性，我们推测这2个位点错义突变可能不是影响精子活动力的主要因素。 tRNAleu(UUR)A3 243G突变是目前发现在多种疾病中发生的致病性突变，近年来，相关 报道表明其为糖尿病的突变热点。在糖尿病中，该位点突变不仅干扰了tRNAleu(UUR)的合成， 而且也妨碍了转录终止因子的结合，导致线粒体蛋白质合成缺陷，线粒体氧化磷酸化受损， 从而造成能量供应不足[9]。我们分析的69例弱精子症标本和60例正常标本均未检测到该突 变，原因可能是:?该位点突变率较低，本研究分析的样本量不够大;?组织的差异，在精 子细胞中该突变频率可能是低的。 【参考文献】 [1] Dada R,Gupta NP,Kucheria K.Molecular screening for Yqmicrodeletion in men with idiopathic oligozoospermia andazoospermia[J].J Biosci,2003,28(2):163-168. 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