卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟影响的设计

燕山大学 课 程 设 计 说 明 书 卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟影响的设计 学院（系）： 年级 专业： 0 学 号： 学生 姓名： 指导 教师： 教师 职称： 燕山大学课程设计（）任务书 院（系）： 基层教学单位： 学 号 学生姓名 专业（班级） 设计题目 卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟的影响 设 计 主 要 内 容 1.卵丘细胞存在对猪卵母细胞成熟的影响 2.卵丘细胞层数对猪卵母细胞体外成熟的影响 设 计 要 求 1.提出设计方案前应充分查阅各种文献资料， 2.要有明确设计的目的,设计合理的操作方式 3.设计出合理的测定指标 4.设计的内容要与题目基本一致 5.设计与分析 工 作 量 1.至少阅读15篇以上的相关科技文献 2.设计文字至少在15000字以上 工 作 计 划 12.28-12.31 查阅资料 1.1-1.3 整理文献 1.4-1.8 设计方案 1.9-1.11 撰写说明书 1.12 检查内容准备答辩 参 考 资 料 [1] 陈大元. 受精生物学[M]. 北京科学出版社, 2000, 51: 147-148. [2] 王海, 曾申明, 朱士恩. 培养介质、卵丘细胞和卵泡直径对猪卵母细胞体外成熟的影响[J]. 中国畜牧杂志, 2002, 38: 15-16. [3] 钱云, 丁家桐, 刘红林. 卵母细胞成熟的形态学特征及其调控[J]. 国外畜牧科技, 2001, 26: 26-30. 指导教师签字 基层教学单位主任签字 说明：学生、指导教师、基层教学单位各一份。 年 月 日 燕山大学课程设计成绩评定表 设计者姓名: 学号: 设计题目: 说明书成绩评定（满分100分）： 得分 设计内容的切题程度：满分20分 （ ） 设计内容立题合理性：满分10分 （ ） 设计内容的规范程度：满分10分 （ ） 设计书前后内容完整：满分20分 （ ） 设计说明说排版成绩：满分20分 （ ） 设计说明书的工作量：满分10分 （ ） 设计过程平时成绩： 满分10分 （ ） 总分成绩： 指导教师： 年 月 日 答辩成绩评定：（满分100分） 得分 仪表成绩：满分20分 （ ） 口语表达：满分20分 （ ） 幻灯质量：满分20分 （ ） 设计分析：满分40分 （ ） 总分： 教师： 年 月 日 设计撰写成绩 （70%） 答辩成绩 （30%） 合计 教师签字： 年 月 日 2010-2011 秋季学期 生物工程专业课程设计 结题论文 卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟影响的设计 学院（系）： 年级 专业： 学 号： 学生 姓名： 指导 教师： 教师 职称： 摘 要 卵丘细胞是影响卵母细胞成熟的重要因素，尤其是包裹在卵母细胞周围的卵丘细胞。本设计主要探讨卵丘细胞对牛卵母细胞体外成熟的影响。设计内容主要分为两部分：卵丘细胞存在对猪卵母细胞体外成熟影响的设计；卵丘细胞层数对猪卵母细胞体外成熟影响的设计。第一部分设计拟定探索出卵丘细胞的存在能够提高卵母细胞体外培养成熟；第二部分设计是在第一部分的基础上分析卵丘细胞层数对母细胞成熟的影响。通过本次设计，拟定探讨卵丘细胞的存在和不同形态对猪卵母细胞的成熟率的影响。为提高卵母细胞的质量，使体外受精、细胞核移植、转基因及胚胎干细胞等技术研究的顺利进行，而作为这些研究基础环节的卵母细胞体外成熟技术尤为重要。 关键词：卵丘细胞；猪卵母细胞；体外成熟 目 录 1 第一部分 文献综述 1 1.哺乳动物卵母细胞体外成熟研究进展 1 1.1卵母细胞体内成熟的生理机理 1.2卵母细胞体外成熟的机理 1 2. 影响猪卵母细胞体外成熟的因素 2 2 2.1影响猪卵母细胞体外成熟的生理性因素 2 2.1.1 卵巢来源猪的年龄、品种及健康状况 2.1.2所采集卵巢所处的性周期 2 3 2.1.3采集卵巢离体时间及保存温度 2.1.4采集卵母细胞的 3 2.2影响猪卵母细胞体外成熟的物理性因素 3 2.2.1 体外成熟培养条件 4 2.2.2体外成熟培养时间 4 2.2.3体外成熟培养方式 4 2.3影响猪卵母细胞体外成熟的化学性因素 4 2.3.1成熟培养基 4 2.3.2激素 5 2.3.3血清 5 2.3.4卵泡液 6 2.3.5细胞生长因子 6 3.卵丘细胞与卵母细胞关系的研究进展 7 3.1卵丘细胞与卵母细胞在卵母细胞成熟过程中的结构与功能联系 7 3.2卵丘扩展对卵母细胞体外成熟的影响 8 3.3卵丘细胞层数对卵母细胞体外成熟的影响 9 3.4去除卵丘细胞的卵母细胞在体外成熟过程中的超微结构变化 10 11 第二部分 课程设计部分 11 1.实验材料 11 1.1 卵巢 11 1.2 实验用的仪器 12 1.3 实验试剂 12 2.方法 12 2.1 卵丘-卵母细胞复合体（COCs）的收集 12 2.2猪卵母细胞的分级 13 2.3卵母细胞的成熟培养 13 2.4各组卵母细胞的成熟观察 13 3. 设计 13 3.1卵丘细胞存在对卵母细胞体外成熟的影响 13 3.2卵丘细胞层数对卵母细胞体外成熟的影响 14 4.分析与总结 14 4.1卵丘细胞存在对卵母细胞体外成熟的影响 14 4.2卵丘细胞层数对卵母细胞体外成熟的影响 15 5.设计体会 16 参考文献 第一部分 文献综述 1.哺乳动物卵母细胞体外成熟研究进展 1.1卵母细胞体内成熟的生理机理 卵母细胞成熟是指卵母细胞恢复和完成第一次减数分裂，进入并停滞于第二次减数分裂中期，此间伴随着胞浆成熟，即卵母细胞的成熟包括其核成熟和胞浆成熟两个方面[v]。核成熟是核膜破裂，同源染色体分离和排出第一极体；胞浆成熟是胞浆内各种蛋白组成达到一定水平及线粒体的有效重排。 1.2卵母细胞体外成熟的机理 卵母细胞体外成熟（IVM）是指在体外人工给定的条件下，哺乳动物次级卵母细胞经过一系列的生长发育最终形成有受精能力的成熟卵母细胞的过程。卵母细胞的体外成熟包括细胞核的成熟、细胞质的成熟、卵丘细胞的成熟、透明带的成熟以及其卵丘-卵母细胞复合体的发育成熟等一系列复杂的变化过程，主要表现在细胞核成熟和细胞质成熟两个方面。在形态学方面表现为纺锤体形成，核仁致密化，染色质高度浓缩成染色体，第一极体释放，细胞器重组，卵丘细胞扩展、膨胀和透明带软化等一系列生理变化[vii]。 细胞核成熟即卵母细胞恢复减数分裂，发生生发泡破裂(genninal vesiclebreakdown，GVBD)并发育到第一次减数分裂中期；与此同时，卵母细胞进一步跨越第一次减数分裂中期，排出第一极体(第一极体含有极微量的细胞质，不久就退化)并停止于第二次减数分裂的中期，直到受精(或激活)后才完成第二次减数分裂并排出第二极体。 细胞质的成熟包括细胞器的变化和细胞基质的变化，皮质颗粒在胞质合成后，逐渐迁移到质膜下的皮质区。高尔基复合体最初位于核的周围，成熟过程中移向皮质，皮质颗粒完全形成后，高尔复合体在皮质中消失。发育早期的线粒体为圆形或椭圆形等，主要分布于皮质部，卵母细胞成熟后，线粒体又移向核周围，形成幼稚型线粒体。随着卵母细胞的成熟，粗面内质网减少，而滑面内质网增多，到成熟晚期，滑面内质网变得很少。胞质成熟一个非常重要的特点是积累一些稳定的mRNA，并在卵母细胞成熟到一定阶段进行蛋白质翻译。有些细胞质成熟过程依赖于细胞核成熟。 透明带软化也是卵母细胞成熟的标志。透明带是一层糖蛋白膜，受精时可以结合并诱导精子发生顶体反应，并阻止多精受精。 在卵母细胞的成熟过程中，有很多化学物质及因子参与反应，因此，只有当体外成熟条件与体内卵母细胞发育所需要的环境非常接近时，才能获得较高的成熟率，从而为进一步的科研工作提供优质大量成熟的卵母细胞。 2. 影响猪卵母细胞体外成熟的因素 2.1影响猪卵母细胞体外成熟的生理性因素 2.1.1 卵巢来源猪的年龄、品种及健康状况 同一种动物在不同年龄段其卵母细胞在体外成熟的情况也有所不同。从初情期前的青年母猪卵巢中获得的猪卵母细胞经过体外成熟培养后可得到IVP 后代，但是，成功的效率不如经产母猪卵巢体外成熟的卵母细胞。 不同的国家和地区之间，猪的品种必定存在着遗传因素、饲养环境和气候条件等等的因素而带来品质上的差异，从而影响猪卵母细胞的质量进而对体外成熟培养也产生一定的影响。 而即使是从同一品种和统一地区的猪种所获得的卵母细胞进行体外培养，其培养效果也会因猪的健康情况和卵巢质量等的影响而有很大的不同，比如，处在育龄盛期的健康母猪，其卵巢的体积大，表面卵泡多而且直径在3-6mm 的卵泡相对比例就会较高，抽得的卵母细胞形态完好，裸卵少，相对体外成熟培养效果也好。反之，取自仔猪、处女猪、老母猪及老弱病残猪的卵母细胞的体外成熟培养效果则较差。 2.1.2所采集卵巢所处的性周期 所采集的卵巢所处的性周期同样影响卵母细胞体外成熟培养结果，根据采集卵巢所处的性周期，将其分为卵泡期和黄体期，再将黄体期卵巢分为有黄体期卵巢和无黄体期卵巢。无黄体期卵巢上的卵母细胞比黄体期卵巢上卵母细胞成熟效果要好。崔亚利等认为猪卵泡期卵母细胞的培养效果要高于黄体期，但差异不显著。彭辉等研究表明，在牛卵母细胞的体外成熟培养中，有着同样的结果，即卵泡期卵母细胞的体外成熟培养结果要高于黄体期[xxvi]。因此，卵巢所处性周期不同，卵泡内的能量物质、激素浓度等也会随之而发生变化，进而影响了体外成熟培养的结果。 2.1.3采集卵巢离体时间及保存温度 一般而言，卵巢离体的时间要求在2~4h 内，时间越短，所获得的卵母细胞的质量越好，体外成熟培养的效果也越好。文国艺等[xxvii]研究认为，猪卵巢离体时间越短，其卵母细胞的卵裂率越高，并且随着离体时间的延长而降低。相对于其他哺乳动物而言，猪卵母细胞对温度的敏感度较高，较高或较低都会直接影响到体外成熟的效果，一般来讲，猪卵巢的保存温度在28~35℃，文国艺等研究表明，当卵巢的保存温度低于25℃，猪卵母细胞体外成熟收到明显的影响并进而影响到受精的结果。2.1.4卵泡的大小及卵丘细胞目前，普遍认为进行体外培养的猪卵母细胞在3~8mm，培养效果较好。Yoon等研究发现来自3~8mm直径卵泡的卵母细胞成熟率显著高于小于3mm的卵泡卵母细胞(91%vs 58%)。韩毅冰等也证明小直径卵泡卵母细胞(<1~2 mm)成熟率不如大直径卵泡卵母细胞（2~6mm）。但在特别大的卵泡中有些卵母细胞有严重退化的现象。 大多数哺乳动物的卵母细胞被卵丘细胞包裹形成COCs）。排卵之前，卵丘细胞扩展，合成大量胞外基质，并富含透明质酸（Hyaluronic：HA），有利于排卵后进入输卵管，同时保证了卵母细胞正常的受精和胚胎发育潜力，所以，卵丘细胞的扩张对卵母细胞成熟，特别是卵母细胞胞质成熟起着重要作用。根据卵母细胞外面包裹的卵丘细胞的层数将其分成三级。A 级：卵丘细胞在3 层或3层以上。B 级：卵丘细胞为1~2 层；或卵丘细胞虽在3 层或3 层以上，但是不完整，部分为1~2 层。C 级：裸卵或卵丘细胞虽为1~2 层或多层，但是不完整，部分裸露。A 级卵母细胞的培养效果要优于B 级和C 级。 2.1.4采集卵母细胞的方法 目前，常用的采集猪卵母细胞的方法有三种即抽吸法、切割法和刺破法，相对于刺破法和切割法而言，抽吸法较为常用，但是所获得的卵母细胞质量较差，甚至出现较多的裸卵，进而间接地影响了体外培养的效果。 2.2影响猪卵母细胞体外成熟的物理性因素 2.2.1 体外成熟培养条件 温度 不同动物的卵母细胞所需要的体外成熟培养温度因动物种类的不同而不同，猪所需要的温度一般为38℃~39℃较为适宜，过高或过低都不利于细胞的发育。 湿度 在IVM 时一般采用的是饱和湿度，目的是减少培养基内的水分蒸发，从而维持培养基中卵母细胞所需要的各种物质的浓度及保持渗透压。通常在培养基上面覆盖一层石蜡油或矿物油，以使在培养箱内或离箱操作时维持培养基的气相、湿度与pH 值。此外，培养箱所用的水的纯度和高度无菌也是培养成功的关键性因素。 气相环境 目前卵母细胞常用的培养气相有两种即是5%CO2、5%O2、90%N2和5%CO2、95%的空气[xxxii]。在这两种气相中，CO2 的含量很关键。多数培养基在配制前都已将pH 值调好，并具有一定的缓冲能力，因此，5%CO2 则刚好是维持pH 所必需。另外，要保证所用气体的无毒。 2.2.2体外成熟培养时间 不同动物的卵母细胞所需要的体外成熟培养时间因动物种类的不同而有所不同，大多数哺乳动物所需要的体外培养时间为22~24h，但是对猪而言，却需要更长的时间，一般，猪卵母细胞体外成熟培养的时间为44h。Sosnowki 等研究发现培养40~48 h 与30~36 h 对猪卵母细胞体外成熟率差异显著，但是分析染色体核型发现，随着体外培养时间的延长，染色体异常率会随之增加。 2.2.3体外成熟培养方式 目前，常用的猪卵母细胞体外成熟培养方式有微滴培养法、套皿培养法及普通的单皿培养法。相对于普通的单皿培养法而言，微滴培养法和套皿培养法可以更好的保持细胞发育所需要的微环境，同时减少微生物的污染。李俊等研究认为在猪卵母细胞体外成熟培养中，套皿培养法可以代替微滴培养法中矿物油的作用，从而可以减少矿物油对细胞的危害。 2.3影响猪卵母细胞体外成熟的化学性因素 2.3.1成熟培养基 成熟基础液的构成,直接影响到卵母细胞的成熟率及以后的受精和胚胎发育。猪卵母细胞的IVM 液有Whitten's medium，NCSU-23，TCM-199NCSU-37。目前猪卵母细胞体外培养的基础培养液以TCM-199和NCSU-23使用较多。成熟培养的基础培养液不同卵母细胞成熟后GSH 的含量存在显著差异，IVF后雄原核形成率也不同。Wang等人的研究显示在NCSU-23 中成熟的卵母细胞IVF 后囊胚发育率显著高于在TCM-199 和改良Whitten's 液中Lalantha等人认为在不添加蛋白质添加物的情况下TCM-199 更有利于卵母细胞的核成熟，而在Waymouth基础液中成熟的卵母细胞其核成熟率雄原核形成率和囊胚发育率较低。王海等研究发现，卵母细胞在两种培养液中的成熟率差异不显著。但叶华虎等研究发现，受精后胚胎发育能力NCSU-23占明显优势。 2.3.2激素 在卵母细胞的体外培养体系中，FSH、LH 有利于改变卵丘细胞的代谢机能，并阻断卵丘细胞通过胞间连接向卵母细胞分泌减数分裂抑制因子的途径，从而使卵母细胞恢复成熟分裂过程 。在猪卵母细胞体外成熟研究中，许多学者都选择添加PMSG,有人还认为添加PMSG 和hCG 的组合对猪卵母细胞核成熟的促进作用优于添加FSH 和LH。尤其对于LH 的添加存在争议，有研究者认为LH 在卵母细胞培育过程中并未发挥作用，Izadyar 等认为在不含血清的成熟培养液中，只有FSH 能影响卵母细胞的成熟，而LH 没有作用；Bevers 等认为小于8mm 的牛卵泡中，颗粒细胞上只有FSH 受体mRNA，而没有LH 受体mRNA。但彭礼繁等却认为LH 对猪卵母细胞体外成熟的促进效果要强于FSH。 在早期的研究中，促性腺激素多数存在于整个体外培养过程，但1994 年，Funashi 等的研究表明，在猪卵母细胞IVM 时，培养前20 h 加入PMSG、hCG、E2，而在培养后20 h 去除，可增加卵母细胞的成熟率，同时可以促进卵母细胞减数分裂和胞质的成熟，而且有利于卵母细胞的发育和受精。蔡令波等在培养后期去除促性腺激素也得出了相似结果。 2.3.3血清 自20 世纪80 年代血清应用于卵母细胞的体外成熟培养以来，血清在卵母细胞体外成熟培养的作用逐渐被发现并利用，血清中含有许多成分包括能量物质、氨基酸、维生素、激素、生长因子和细胞因子等等能够促进原始卵泡卵母细胞生长启动，并提供生长所需的一种或几种因子，因而，培养液中添加动物血清可促进卵母细胞成熟。在猪卵母细胞体外培养中，用得最广泛的是在成熟培养液中添加10%的胎牛血清（Fetal bovine serum，FBS）。蔡令波等曾研究表明发情牛血清（Estrus cows serum，ECS）较新生犊牛血清（Newborn Calf Serum，NCS）更有利于猪卵母细胞体外成熟。近年来，许多研究者又在猪的卵母细胞成熟培养液中添加一定比例的猪血清，其中包括:新生仔猪血清，母猪发情的血清等。 虽然血清对于猪卵母细胞的体外培养有较好的促进作用，但是血清也有其本身固有的不利因素，如血清中所含有的激素、维生素、细胞因子、生长因子，以及许多未知物质，并且容易被支原体感染。此外血清的来源不同、批次不同均会导致血清中所含组分及组分间比例不同，从而导致了卵母细胞体外成熟、体外受精和体外培养的不稳定。因此，寻找比较适宜的血清替代品成为当前的一大研究热点，目前用来代替血清的替代品有牛血清白蛋白(Bovine SerumAlbumin ， BSA) 、聚乙烯醇(Polyvinyl Alcohol ， PVA) 、聚乙烯毗咯烷酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)等大分子有机物质。 2.3.4卵泡液 猪卵泡液(pig follicular fluid，pFF)是猪卵母细胞发育的微环境，对卵母细胞的成熟有着重要的调节作用，主要表现在提高猪卵母细胞成熟的质量并增加胚胎的发育能力。Naito 等[xlv]的研究认为：在体外成熟培养中，PFF 可以促进猪卵母细胞胞质的成熟，并显著提高猪卵母细胞受精后的原核形成率。Yashida 等报道在成熟培养基中添加猪卵泡液可显著提高猪卵母细胞的核成熟率、正常受精率及卵裂率。Vatzias 等研究发现冷冻卵泡液在促进卵母细胞的成熟、降低多精受精方面优于新鲜卵泡液，孟庆刚等认为在激素存在的条件下，pFF 具有促进猪小腔卵泡卵母细胞体外成熟的作用。 2.3.5细胞生长因子 与卵母细胞体外成熟相关的细胞生长因子主要包括表皮生长因子(Epidermal growth factor，EGF)，胰岛素样生长因子(insulin-like growth factors，IGF)、成纤维细胞生长因子(Fibroblast Growth Factor，FGF)、转化生长因子(transforming growth factor，TGF )及神经生长因子(nerve growth factor，NGF)等，这些细胞生长因子之间相互作用，对卵母细胞的成熟、受精与卵裂起着重要作用。 目前已经证实，EGF 可以促进猪卵母细胞的核成熟。Abeydeera的研究表明，EGF 能提高卵母细胞成熟过程中蛋白质的合成，从而提高卵母细胞胞质的质量，IGF 对细胞具有促分裂、分化及促代谢等生物学功能，是一个具有多种生理功能的生长因子，因此，同样能促进猪卵母细胞的成熟，并能提高所得胚胎的发育能力。TGF-α，在结构上和功能上与EGF 相似，因而也可以与EGF受体结合，诱导猪卵丘细胞的扩散，促进卵母细胞核成熟。NGF 也是猪卵母细胞体外成熟过程中重要的调节物质之一，能影响猪卵母细胞成熟的动力学，加快进入M11 期。 3.卵丘细胞与卵母细胞关系的研究进展 卵母细胞的体外成熟可以为细胞核移植、转基因等胚胎工程的研究提供大量卵母细胞。在排卵前，由于促性腺激素的作用，卵母细胞完成减数分裂的同时，卵丘卵母细胞复合物（4C4D）的卵丘发生扩展，4C4D在体外成熟培养过程中也发生类似的变化。卵丘细胞与卵母细胞、卵丘扩展与卵母细胞成熟之间的关系很复杂。本文主要对卵丘细胞在卵母细胞体外成熟培养过程中的作用加以阐述，进而对卵母细胞的体外成熟培养加以改进。 3.1 卵丘细胞与卵母细胞在卵母细胞成熟过程中的结构与功能联系 卵母细胞的发育成熟与其周围的卵泡细胞的作用是分不开的。原始卵泡由位于中心的卵母细胞和其周围的一层扁平卵泡细胞组成。此时卵母细胞处于第一次减数分裂前期，以后随着卵母细胞开始生长，卵泡细胞迅速增殖，由单层变为多层。在这些卵泡细胞内，线粒体和粗面内质网丰富。 卵泡细胞和卵母细胞伸出突起穿过透明带互相联系。到有腔卵泡时，卵泡细胞分为两部分：一部分为壁层颗粒细胞，与基膜相连：另一部分为包围卵母细胞的卵丘细胞。壁层颗粒细胞与卵丘细胞之间，卵丘细胞与卵丘细胞之间以及卵丘细胞与卵母细胞之间，存在着广泛的缝隙连接。卵泡中的缝隙连接使壁层颗粒细胞、卵丘细胞和卵母细胞共同形成一个结构和功能上的合胞体[1]。处于成熟阶段的卵母细胞，卵丘细胞通过大量充满肌纤维蛋白的带状结构紧密包裹着透明带，保持卵母细胞和卵丘细胞之间缝隙联系，进行离子交换和一些小的代谢物质的交换。卵母细胞所需的营养物质依赖卵丘细胞提供，两者间通过缝隙连接进行信号传导，进而调节卵母细胞的生长和成熟。裸卵仅能够利用周围介质中的丙酮酸和三羧循环的中间产物，不能直接利用葡萄糖卵丘细胞可将葡萄糖转化为丙酮酸，为卵母细胞的生长和发育提供能量。如果两者间缝隙连接过早破坏，卵母细胞可能停止发育［2］。 卵丘细胞合成的一些蛋白质启动和抑制卵母细胞生长和成熟。体外成熟过程中卵丘细胞的构成蛋白和新生蛋白都有明显改变，如果在培养过程中去除卵丘细胞将明显降低牛卵母细胞成熟、受精和胚胎发育能力［3］。总之，在卵母细胞成熟过程中，卵丘细胞对卵母细胞的发育是必需的。卵丘细胞与卵母细胞间的作用机制先前认为是一些生长因子如表皮生长因子（EFG）、胰岛素样生长因（IGF-1）通过卵丘细胞对卵母细胞行使促成熟影响，但目前证明生长因子对牛和鼠的裸卵也有促成熟作用，卵母细胞也存在IGF-1受体mRNA。因而卵丘细胞对卵母细胞成熟的启动似乎并不起主导作用，应该只能认为是起加强或减弱的辅助作用。这可能是由于牛卵母细胞在体外大部分可自发恢复减数分裂并发育至成熟。 尽管如此，据报道卵母细胞成熟过程中卵丘细胞对卵母细胞受精后至囊胚的发育是必不可少的。S.Hashimoto等人报道培养液中，添加卵丘细胞(1.6×106个／mL)可以促进牛有完整放射冠的卵母细胞的发育，但在培养液中，添加与COCs中卵丘细胞浓度相同的卵丘细胞数（4.2×106个／mL）对于裸卵的发育无作用，1.6～3.2×106个卵丘细胞／mL对于带有完整缝隙连接的卵母细胞的体外成熟效果最好。可见卵丘细胞是影响卵母细胞体外成熟的重要因素之一。 3.2 卵丘扩展对卵母细胞体外成熟的影响 在卵母细胞成熟过程中，卵丘细胞也随之成熟而充分扩展，从而中断了卵丘细胞之间以及卵丘细胞与卵母细胞之间的紧密连接状态，进而疏通了这些细胞之间营养物质交换的通道。卵母细胞也可能通过分泌特殊因子或通过促卵泡素（FSH）和EGF刺激卵丘透明质酸酶的合成，调节卵丘扩散，从而解除卵丘-卵母细胞的异源连接，促使减数分裂恢复。卵丘细胞是否成熟是卵母细胞成熟的重要标志，只有两者均成熟时，精子才能有效地穿透卵子并进而发生卵裂［10］。卵丘扩展常用作判断卵母细胞体外成熟的特征，Hunter和Moor根据卵丘细胞扩展情况制定了牛卵母细胞体外成熟的判断标准：1级成熟卵为“卵丘细胞完全扩展”；卵丘细胞团至少扩展-倍于裸卵直径（300µm）；,级成熟卵为“卵丘细胞中等扩展”，卵丘细胞向外扩展约,倍于裸卵直径（200µm）；-级成熟卵为“卵丘细胞轻度扩展”，卵丘细胞仍紧紧地粘贴在透明带上。一般绝大多数的1级成熟卵和多数的2,级成熟卵均已达到成熟状态，排出第一极体. 卵丘扩展与卵母细胞成熟之间的关系很复杂。在小鼠，去除卵母细胞的COCs即使在含有FSH的培养液中卵丘也不能扩展，说明卵丘扩展依赖于卵母细胞；但是如果在小鼠的COCs培养基中加入硫酸胺G和肝素，虽能抑制FSH或EGF诱导的卵丘扩展，但对卵母细胞成熟却无影响，说明卵母细胞成熟不一定依赖于卵丘扩展。孙兴参等实验中卵丘扩展良好或不好对卵母细胞核成熟没有明显的影响，得出猪卵丘细胞扩展不依赖于卵母细胞［4］。在体内卵丘扩展可促进精子获能，保证正常受精和合子发育。但最近的报道对=>:过程中卵丘扩展在支持胚胎发育上提出质疑。卵丘扩展对牛卵母细胞体外成熟不是必需的。卵丘扩展对卵母细胞核成熟没有明显影响。至少与细胞质进一步成熟无直接关系。因此，需要进一步研究来确定卵丘扩展与卵母细胞成熟是否有关系. 3.3卵丘细胞层数对卵母细胞体外成熟的影响 卵母细胞周围的卵丘细胞层数是影响卵母细胞成熟的重要因素。不同的研究者对卵母细胞的分类不尽一致。目前的研究中，回收的大部分卵母细胞都有完整的卵丘细胞包围（致密或分散）。卵丘细胞的形态不依赖于供体的类型，拥有完整多层并且扩散的卵丘细胞的卵母细胞的比例最大（39.3％～46％），其次是带有致密多层的卵丘细胞的卵母细胞（26.9％～28％），裸卵的比例小于7％。这些结果与Abdoon的报道一致，他也发现大部分的卵母细胞有5层或更多层的卵丘细胞，并且具有均匀致密的卵质。H.Tomer实验结果得出，具有多层的卵丘细胞（致密或分散）的卵母细胞55％以上到达染色质结构双线期，具有体外发育完全的最大潜力。 李荣凤等实验，以皮层颗粒（CG）单层分布于质膜下做为卵母细胞质成熟的指标，分别于成熟培养前后观察各类卵子的CG分布情况。结果证实裸卵成熟培养后CG完全消失或卵子本身形态出现异常。可见，裸卵是一类尚未成熟即趋于退化的卵子，不能正常受精及进一步发育。卵丘细胞已扩散成蜘蛛网状的卵子成熟培养前后的质成熟率均显著高于多卵丘细胞和少卵丘细胞卵，而其受精后的发育潜力（囊胚发育率3.40％）却明显不及后两者（囊胚发育率28.70％和23.10％）。结果还表明，卵泡直径与卵丘细胞多少具有相关性，卵泡越大，多卵丘细胞卵所占的比率越高［11］。 综上所述，在卵母细胞体外成熟过程中，卵丘细胞发挥着至关重要的作用。体外成熟培养时，需选择从直径大于2mm卵泡内吸出的卵丘细胞致密的多卵丘细胞卵进行培养。尽管目前卵丘扩展程度可作为卵母细胞成熟的标志之一，但卵丘扩展对卵母细胞体外成熟不是必需的。对于卵丘细胞与卵母细胞联系的内在机制仍需进一步研究。 3.4 去除卵丘细胞的卵母细胞在体外成熟过程中的超微结构变化 去除卵丘细胞会降低小鼠卵母细胞的成熟质量。利用透射电子显微镜技术观察去卵丘细胞的小鼠卵母细胞体外成熟过程中的超微结构变化，目的是在亚细胞水平上寻找由于卵丘细胞的去除而导致卵母细胞质量降低的原因。(1) 去除卵丘细胞的小鼠卵母细胞在体外成熟过程中微绒毛由细长到短粗，由倒伏到直立均与卵丘卵母细胞复合体成熟过程中微绒毛变化规律相符。(2) 去除卵丘细胞的小鼠卵母细胞在体外成熟过程中线粒体由簇状分布逐渐变为散布于卵质内，该过程与卵丘卵母细胞复合体成熟过程中线粒体变化规律相符。(3) 去除卵丘细胞的小鼠卵母细胞在体外成熟过程中，皮质颗粒可能存在继发性生成障碍或者数量异常，该结果可能是去除卵丘细胞的小鼠卵母细胞存在体外受精障碍的原因之一。 第二部分 课程设计部分 卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟的影响 获取高质量的体外成熟卵母细胞是成功进行人类体外受精、动物胚胎生产和克隆的关键。尽管动物卵母细胞能够在体外自发完成细胞核成熟，但卵母细胞成熟质量远不如体内成熟卵母细胞，其受精后胚胎发育能力较差。目前认为，这可能是由于体外成熟的卵母细胞胞质成熟不充分造成的。研究表明，卵母细胞体外成熟培养系统与受精率和囊胚发育率有强相关性。所以，继续深入认识卵母细胞的成熟规律、改善体外成熟培养环境、建立一种完善的卵母细胞体外成熟系统是当前胚胎工程研究的重要内容之一。 尽管研究证明，卵泡细胞在卵母细胞胞质成熟过程中起到了重要的作用，但对于不同类型细胞发挥的具体作用以及作用机制的理解还比较匮乏。本研究主要目的有两点：第一，深入探讨卵丘细胞支持卵母细胞胞质成熟的作用机制；第二，通过改善体外成熟培养系统，最大限度的提高裸卵的体外成熟及发育能力，为生发泡移植和GV期卵母细胞冷冻保存等技术提供有效的裸卵成熟方法。因此，本研究通过对机械裸卵和COCs进行体外成熟，经体外培养而探讨卵丘细胞存在和不同形态卵丘细胞对卵母细胞体外成熟与孤雌发育能力的影响。 1.试验材料 1.1 卵巢 猪卵巢采集自河北省秦皇岛市海滨区新店子屠宰场。猪宰杀剖腹后，立即无菌剪下卵巢，挑选黄体期和红体较少，卵泡直径约3~5 mm、大小均匀的卵巢，使用37 ℃的PBS缓冲液冲洗干净，置于37 ℃的PBS缓冲液4h内带回实验室。 1.2 试验用的仪器 仪器 厂商 型号 体式显微镜 日本Nikon SMZ 荧光显微镜 日本Nikon E600 全自动高压消毒锅 日本Yamato SM-51 CO2培养箱 美国 BINDER 低温台式高速离心机 德国 Eppendorf 自动数字天平 AD EK-120A 液氮罐 Taylar-Wharton 1.3试验药品 药品 厂商 TCM199 GIBCO Hepes SIGMA FCS SIGMA FSH 宁波市激素制品有限公司 LH 宁波市激素制品有限公司 PFF 自制 青霉素 大连美罗大药厂 链霉素 大连美罗大药厂 蔗糖 上海生物优先公司 Gly SIGMA DMSO SIGMA 0.25ml细管 北京耀北生物技术公司 四孔板 北京耀北生物技术公司 2.方法 2.1猪卵丘-卵母细胞复合体(COCs)的收集 从屠宰场收集卵巢后，放入35℃双抗生理盐水中，用保温瓶在3 h 内运到实验室，去除血污。然后用带有18G针头的一次性注射器，抽吸直径2 ~10 mm卵泡中的卵泡液。吸卵液为TCM199+25 mmol/L HEPES+10 μg/mL肝素+4.0 g/L BSA。吸出液收集在35 mm一次性培养皿中，静置5~10 min后，在实体显微镜下挑选形态及颜色正常的、细胞质均匀的卵母细胞。 2.2 猪卵母细胞的分级 收集的未成熟猪卵母细胞以卵丘细胞层数为准分为三级：A级：卵丘细胞在3层或3层以上。B级：卵丘细胞为1～2层；或卵丘细胞虽在3层或3层以上，但是不完整，部分为1～2层。C级：裸卵或卵丘细胞虽为1～2层或多层，但是不完整，部分裸露。 2.3卵母细胞的成熟培养 卵母细胞采用微滴培养法.检出的COCS用含体积分数为5%胎牛血清的DPBS洗涤3次，然后用成熟培养液洗涤3次，最后按实验设计分别移入含有成熟培养液滴的直径35mm培养皿中。每个液滴50μL并覆盖石蜡油，每滴放COCs10~15枚。液滴预先在二氧化碳培养箱中平衡2h以上。成熟培养条件39℃ ,5%的CO2与饱和湿度，二氧化碳培养箱中培养22～24 h。成熟培养液为见试验设计。 2.4各组卵母细胞的成熟观察 成熟24 h时，将各组卵丘一卵母细胞复合体移入含O．25％透明质酸酶的M199(Sigma，M4530)中，移液枪轻轻吹打移除卵丘细胞，体视镜下用玻璃针拨动卵母细胞检查第一极体排出的情况(第一极体排出作为卵母细胞成熟的标志)，并记录各组成熟卵母细胞数及成熟率。 3. 设计 3.1 去除卵丘细胞对猪卵母细胞成熟的影响 先将包裹3层以上卵丘细胞且包裹紧密的COCs随机分为2组：A组, COCs经机械吹打脱除卵丘细胞成为机械裸卵(Dos)，B组, 包裹卵丘细胞3层以上的且包裹紧密的卵丘一卵母细胞复合体记为(COCs)，各自单独培养。 3.2卵丘细胞层数对猪卵母细胞体外成熟的影响 根据包裹卵母细胞的卵丘细胞的完整性分为3组:A组，有3层以上卵丘细胞紧密包围的卵母细胞复合体记为(COCs)；B组，有3层卵丘细胞包围的卵母细胞记为(COCs)；C组，有1～2层卵丘细胞包围的裸露卵母细胞记为(NOs)，3组分别放于相同且适宜条件下培养。探索卵丘细胞层数的多少对猪卵母细胞成熟的影响的大小。 4.分析与总结 4.1去除卵丘细胞对猪卵母细胞成熟的影响 本研究中将包裹5层以上卵丘细胞的COCs经机械脱除卵丘细胞层后，其体外成熟与孤雌胚胎发育能力显著低于正常的COCs，这与Geshi等试验结果类同。这可能是因为在卵母细胞成熟过程中，卵丘细胞通过与卵母细胞间的紧密缝隙连接为卵母细胞的成熟发育提供物质和能量，促进卵母细胞发育成熟。Antezak等和Goud等提出卵泡液和卵丘细胞层可储存和释放某些生长因子和特定蛋白，这些因子和蛋白在卵母细胞的成熟与胚胎发育过程中按一定顺序或选择性地发挥调节胚胎生长发育的作护包裹在卵母细胞外的卵丘细胞层，以提高卵母细胞的体外成熟及后期胚胎发育的潜力。 4.2 卵丘细胞层数对猪卵母细胞体外成熟的影响 卵母细胞周围的卵丘细胞层数是影响卵母细胞成熟及后期胚胎发育的重要因素。刘酷等根据卵母细胞周围卵丘细胞层数对绵羊进行分类成熟培养，发现卵丘细胞包裹3层以上和包裹1-3层疏松卵丘细胞的卵母细胞成熟率分别为82．4％和80．6％，其试验结果与本试验卵母细胞体外成熟结果基本一致，这在一定程度上说明卵丘细胞层包裹程度对卵母细胞体外成熟后体外成熟率并没有显著的影响。 不同类型COCs的孤雌胚胎发育能力却不同，这可能是包裹卵丘细胞较少的卵母细胞在体外成熟后已有老化的趋势，卵裂后发育至囊胚的能力下降，但包裹3层以上卵丘细胞及附带FSP的COCs在体外成熟后孤雌激活时正处于发育的较佳时期，能够很好的发育至囊胚期。本研究结果表明，包裹卵母细胞的卵丘细胞层的存在与其层数对卵母细胞的体外成熟和孤雌激活后胚胎发育的能力具有重要作用。 本设计重点研究了卵丘细胞在卵母细胞体外成熟过程中的作用，初步筛选了有卵丘细胞和无卵丘细胞两种情况下，卵母细胞中差异表达的基因，并且进一步研究卵丘细胞的不同形态对猪卵母细胞体外成熟的影响，为提高卵母细胞的体外成熟效率提供了依据，将有助于更好的利用卵母细胞来为胚胎工程乃至克隆技术服务。 5.设计体会 本次课程设计我选的题目是《卵丘细胞对猪卵母细胞体外成熟的影响》，回想起这些天紧张而又充实，正如赵老师说的，此次设计时间紧任务重。这些天寻找资料，思考设计方案，穿梭于东西校区之间，不仅锻炼了身体，也锻炼了我们的心智，每个人都很认真的学习、准备，老师的严格要求是对我们最好的磨练与监督。 在课程设计的过程中，过的充实而又紧张：查阅资料、文献，确定自己的设计方案，查阅相关资料和课程设计报告的撰写。这一系列的过程中虽然遇到了很多的困难，但是不仅锻炼了信息检索的能力，计算机的熟练应用程度，还促进了和老师、同学之间的交流，真所谓累并快乐着！ 课设的时间快要结束了，无论之前遇到了多大的困难，看到自己的成果还是满心欢喜。整个的课程设计其实就是一个学习的过程，一个能力提高的过程，它会激励我们在今后的学习中，主动去探讨和学习。最后，感谢赵红卫老师严谨的态度和孜孜不倦的教导，他丰富的学识给了同学们很大的帮助。 参考文献 [1] 陈大元. 受精生物学[M]. 北京科学出版社, 2000,51: 147-148. 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