2_芳基丙酸类药物的拆分研究进展

� � � 年 � � �� � 微 生 物 学 通 报 � 一芳基丙酸类药物的拆分研究进展 徐诗伟 徐 清 �中国科学院微生物研究所 , 北京 �� 。。� �� � 一芳基丙酸 �� 一� �� �类药物属非街体抗炎 药 �� � � �� � , 以商品标记最 主要 有布洛芬 ��� � � � � �� � � 和蔡普生 �� � � � � � � � 两种 , 是解 热镇痛 , 消炎抗风湿的基本药物和主要产品 。其 � 位含有一个手性碳原子 , 存在一对光学对映 体 。 近代分子药理学研究�� 表明 , 对映体构型和 活性密切相关 。其中 � �� � 一构型具有高的生理 活性或药理作用 , 而 � �一 � 一构型活性低或无 活性 。如 � �� 一蔡普生活性为 � �一 � 一蔡普 生 的 � � 倍川 , 布 洛 芬 � , 〕 和 非 诺 洛 芬 ��� � � � � � �� � �� ‘�的 � �� 一构型活性分别为其 � �一 � 一构型的� �� 倍和 �� 倍 。但一些� 一� �� 类药 物的 � �一 � 一对映体在生物体内可特异转化为 有效的 � �� � 一构型 , 而逆向转化不能发生 。转 化机理为 � �一 � 一对映体的手性碳原子发生脱 氢作用 , 然后由体内酶立体选择性氢化形成 � �� � 一对映体��, ‘〕。转化程度因药物品种以及生 物种类而异 。 在人体内 , 布洛芬 、 非诺洛芬 、 苯 嗯洛芬 ��� � ! ∀ � � � �� � � 有 明显转化 , 布洛芬还 具有高度易变性 � 酮洛芬 �� � �� � � � �� � � , 氟比 洛芬 ���� � ��� � � �� � � , 卡洛芬 �� � � � � �� � � 转化 率 均 较 低 � 而 蔡 普 生 、 氟 诺 洛 芬 ���� � � � � � � � �� � � 则不发生手性转化� , 一 ’〕。 制备光学纯药物潜在优点在于扩大用药安 全范围 、 提高治疗指数 、 改进制剂质量 、 减少 并发症以及寻找新的适应症 。 世界各专利组织 对光学对映体同样授予专利权 。美国 �� � � � �� � 公司正上市布洛芬的 � �� � 一对映体�� 」� � ����公司也具备制造 � �� 一布洛芬的开发技 术 。药理学和临床新研究结果表明 , 进一步提高 布洛芬的疗效以 � �� � 一布洛芬替代消旋体完 全是合理的 , 不久将投人市场�� ‘〕。 随着当代生命科学和有机立体化学的发展 以及人民保健水准 日益提高 , 供应更多疗效高 、 毒副作用低的光学纯药物已成为现代药物研究 不可缺少的重要 , 这必将促进拆分技术和 不对称合成方法的更大发展 。 时至今日 , 国内外 对 �一 � �� 类药物拆分已有大量研究 , 报道了众 多行之有效的方法 。本文就常用的化学法以及 近年来蓬勃发展的色谱分离法和生物拆分法作 一扼要介绍 。 � 化学法 �一� �� 类药物用一般化学反应合成得到 的总是等量的对映体混合物 , 称为外消旋体 , 将 其拆分是获得光学纯 � �十 � 一� 一� �� 的主要方 法 。 多年来 , 手性有机含氮碱一直是化学动力学 法拆分 � 一� �� 类药物的研究热点 。 已报道了许 多有实用价值的拆分剂如辛可尼丁 、 奎宁 、 脱 氢极胺 �松香胺 � 、 � 一苯烷胺类和 � 一烷葡胺类 等 �� � ·’��。 这些有机含氮碱作为拆分剂在特定条 件下 , 优先析出其中一种非对映体的盐而易被 分离 � 盐分解再生为酸也比醋或酞胺水解容易 , 且不发生消旋化作用 。因此 , 该法操作简便 , 收 率较高 。 较早就用 � �一 � 一或 � �� � 一 � 一苯乙胺 拆分布洛芬分别得到 � �� � 一和 � �一 � 一布洛 芬 , 光学纯度》 �� � �� �� �〔‘�〕。 用葡辛胺拆分 蔡普生得到 � �十 � 一蔡普生 , 收率 �对消旋体 计算 , 下同� � �一� �写 , � � �智� � � �以上〔‘� � 。 其次 , 用手性试剂将� 一� �� 外消旋体衍生 为非对映体的酞胺 、 酷 、 酸醉或嗯哇琳后进行 次级拆分 , 是化学法拆分 �一� �� 类药物的另一 个重要途径 。 常用手性试剂为光学活性胺和醇 。 � � � � 一 � � 一 � �收稿 微 生 物 学 通 报 � � � 年 � � �� � 如用 �一 � 一各氨基丁醇拆分蔡普生一次析晶即 可分离出�� � �� � 一蔡普生酞胺衍生物 , 而得 到 � �� � 一蔡普生总收率 � � � � � , 「� 赌 � � � 。� ’�二。 最近 , � �� � � � 等�� � 口在用手性醇 �� 一轻基醋� 拆 分一 � 一� �� 为单一 � �十 � 一或 � �一 � 一 � 一� � � 时惊奇地发现 , 当将 � 一 乳酸乙酷 、 � 一乳酸异丁 酷和 � 一 � 一轻基 一�一二 甲基丁酸 内酷分别加人 由 三甲胺或二甲基乙胺作为介质的芳基甲基乙烯 酮 中均得到非对映体过量 �� � � �� 一 �� � 的� � � �� 酉旨, 收率� � ! 。 拆分布洛芬 , 最终得到 � �� � 一和 � �一 � 一布洛芬的比例为�� � � , � � � , � · � , � � · � 和�· � , � � � � , 相应总收率为 � � , � � 和 �� , 远超过一般拆分理论值�� � 。拆分过程主 要包含一种手性醇和由消旋酞氯制得的烯酮的 潜手性不对称合成 �图 � � 。反应的立体选择性与 溶剂有关 。 如用三 甲胺 、 二 甲基 乙胺和 � 一 甲基 四氢毗咯均可得到最高�� ��� 一 �� � � � 而三乙 胺 �� � � � � � 和二异丙基乙胺 �� � � � � � 较低 � 在无胺存在时 , �� 下降至�� 。 � � � 石 � � �� � �一 �� 一 � � � 一 �� � 一 � � 一� � 一 � � � � � �一 � � 一 � 二 �二 � � ’� � � � � 一 �� 一 � �� � � �� � � � 一 � � � 】一 � � 一 � � 一� � � �� � 一� � 一 � �� � � �、�� � � 一 � � 一� � � � ’ � � �一 , 一 � � ��范� �� 图 � 手性醇拆分布洛芬 � �一�。一言� 一� � �一二些匕� 。卜� 。一言� 一 ��� � � � �� � � �� 关� �一� �� �� � �� — �� 一�� � � � �� � � � � �� 一~ . ‘~ - ~ A r 一C H 一 C O O C H 3 H C I一 (C H 3)Z C O- -一一门硬 , 叮 已 A r 一CH 一C O O ll “卜一BU.笼} 一 图2 由 S 一 2 一氯丙酸氯合成 S (斗一 ) 一布洛芬 除拆分外 , 化学法合成 S (+ ) 一 2 一 A P A 类 药物还可由手性合成原以及借助于手性催化剂 对潜手性化合物进行不对称合成 。 起初 , 曾用 S一乳酸或 S 一丙氨酸为起始物合成光 学活性2- A pA 。 近来 , p i e e o l o 等[‘’]改用由 s 一 2 一氯丙酸氯 为起始物合成 S (十 ) 一布洛芬和 S (+ ) 一蔡普 生 。在最适条件下 , 收率分别为37 % 和30 % , 光 学纯度82 % 和96 % 。 这一合成的关键一步是用 锌盐催化重排 S 一芳基一 l 一氯 乙基酮缩二醇为 S- 2一芳基丙酸 甲醋 (图2) 。 R a j a n B a b u 等已, R〕用手性 配位体 Ni (C O D )2络合苯基4 , 6 一 0 一苯亚甲基- p一 D 一毗喃葡糖昔衍生的1 , 2 一双二芳基卑麟酸醋 催化6一 甲氧基一 2 一蔡基乙烯和 于长 ’N 不对称加成 反应合成 S (十 ) 一蔡普生前体 S (一 ) 一 2 一 (6 - 甲氧基一 2 一蔡基) 丙睛 , 收率可达85 % 以上 ; 以 乙醚 一正 己烷重结晶得到对 映体过量 (ee) > 年 22(2) 微 生 物 学 通 报 99 写 S (一 ) 一乙睛 , 将其水解即得到光学纯 S (+ ) 一蔡普生 。 2 色谱分离法 色谱法 (T L C G L C 和 H P L C )分离2一A P A 类药物对映体 , 对药物质量控制 、 立体选择性 的药理学和毒理学 的研究都是十分重要的手 段 , 既可用于常规的或生物样品的分析 , 也适 用于制备小量样品; 具有简便快速 、 分离效果 好和光学纯度高等优点 。 色谱法 是从 70 年代后 期 开 始用 于 手 性 H P L C 的研究 , 迄今已取得了令人瞩 目的进展 , 发展 了多种方法 。 大致说来 , 分离手性化合物主 要是用手性试剂将一对对映体衍生为两种非对 映体 , 再以常规正相或反相间接分离 , 或者直 接 用 手 性 流 动 相 (C M P ) 或 手 性 固 定 相 (C SP ) 分离对映体 。对2一 A P A 类药物对映体的 色谱分离以手性衍生色谱和 C S P 色谱为主 。 手性衍生色谱一般是用 手性胺 或醇将2- A PA 衍生为非对映的酞胺或酷 , 然后利用非对 映体的物化性质差异 以常规色谱法分离 。 用 L - 1一 (4 一二 甲氨基 一 1 一 蔡基) 乙胺衍生蔡普生为非 对映体酚胺 , 在 H PI JC 胖P or a s il 正相柱上分离 测定血清中 S (+ ) 一 和 R (一 ) 一蔡普生 , 流动 相正 己烷一四氢吠喃 (80 , 2 6 ) 、 荧光 (凡x32On m · 入。m 4 l o n m ) 检测极限 loopg L‘g〕。 用 R (+ ) 一 a 一苯 乙胺与布洛芬 、 氟 比洛芬或酮洛芬形成非对映 体酞胺 , 选择键合甲基硅酮毛细管柱 G L C 分离 均可在几分钟内达到基线分离咖〕。 在测定生物 体内的布洛芬对 映体代谢作用时 , 用 L (一 ) - 薄荷醇与布洛芬衍 生 为非 对 映体醋 , 可在 H P Le Partisil (10拼m ) 柱上得到分离 , 流动相 为正 己烷一乙醚 (100 :1) , ’二。 在制备非对映体方 面 , M a i t r e 等〔22习用离心薄层色谱 (C T IJC )和制 备液相色谱 (P L C ) 分离制备一些2一 A P A 与 5 (一 ) 一 a 一苯乙胺所形成的非对映体酞胺 。 C TI C 具有快速 、 溶剂消耗低 、 收率 (75一 80 洲) 及 光学纯度 (de > 98 % ) 高等特点 , 制备规模 dg 级 。 而 PL C 可作为选择 g 级规模制备的一种较 好方法 , 但需要昂贵设备及大量溶剂 。 C S P 一般是 用光学纯手性 化合物 以共 价 键或离子键结合在微粒硅胶载体上制成的 。 药 物对映体与 C SP 的作用是根据 “三点手性识别 模式” 生成非对映体络合物的相对强度而决定 一对对映体的分离程度和洗脱顺序 。 由这一作 用原理设计制备了一系列 CS P[ 23〕。 80 年代初 , P i r k l e 发展 了3 , 5 一二硝基苯甲酞 (D N B ) 氨基 酸类 C SP , D N B 是作为接受 7r一二 键相互作用的 重要基团 。 这类 Pi rkl e 型 CS P 一般不适于直接 分离胺 、 酉旨和梭酸类对映体 , 而将它们转化为 酞胺衍生物则较易分离 。 特别是用 (R ) 一 N 一 ( 3 , 5 一 二硝 基 苯 甲酞) 苯甘 氨酸 「(R ) 一 D N B - P G 〕键合在 y 一氨基丙基二氧化硅载体上制成 CSP , 广泛用于分离2一 A P A 酞胺对映体 , 流动 相常用正 己烷 一异丙醇 , 必要时乙睛作改性剂 , 根据三种作用力 (芳基间 二一 7r 作用 , 酸胺偶极间 静电作用和氢键作用 ) 相互作用模式 , 可推断 S (+ ) 一构型先流出 。 我们在研究微生物酶不对 称水解 (士 ) 一布洛芬醋生成 S (+ ) 一布洛芬时 , 用共价型 (R ) 一D N B 一 P G C S P 柱有效分离布洛 芬 N 一N 一 ( 二苯基) 酞胺对映体 , 分离 因子 (a) 一 2 7 , 分离度 (R , ) 1 . 4 7 , I O m i n 内完成 分离 , 并以消旋体为外标测定样品或酶水解反 应 液中S (+ ) 一布洛芬的 ee (% )〔2‘〕。 G a s p a r r i n i 等[, 5〕用 (IR , Z R ) 一 N , N ’一 ( 一 3 , 5 一二硝基苯 甲 酞 ) 二 氨 基 环 己 烷 仁(R , R ) 一 D N B - D A C H ] C S P 柱进行 H PL C 拆分8种2一 A P A 类 药物 、 布洛芬 、 蔡普生 、 非诺洛芬 、 氟比洛芬 、 氟诺 洛芬 、 酮 洛芬 、 唆 洛芬酸 (tiaprofen ie aeid ) 和舒洛芬 (suprofen) 的 N 一 ( 1 一蔡基)一酞 胺对映体 。除舒洛芬 (a 1. 10) 部分分离外 , 其 余均达到基线分离 。 。 在1 · 23 一1.83 之间 , 洗脱 次序与 (R ) 一D N B 一 P G C S P 的一致 。 由于手性识别的可逆性 , D N B 也常适用于 对溶质的衍生 。 Pi r kl e 等 厂2‘·曾用 (S ) 一 N 一 ( 2 一蔡 基) 丙氨 酸 10 一 十 一 烯酷 C SP 分 离布 洛芬 N - (3 , 5 一二 硝基苯基 ) 酞胺对映体 a 为 1.33 , K e r n 乞2, 〕用 (R ) 一 N 一 ( 2 一蔡基) 丙氨酸 C Sp 拆分 蔡普生 N 一 ( 3 , 5 一二硝基苯基) 酞胺 , 流动相正 己烷一异丙 醇 (9 O , 1 0) , 也 可达基线分离 (a 1.34) , 洗脱次序恰与 (R ) 一 D N B 一 P G 相反 , R 微 生 物 学 通 报 1995年 22(2) (一 ) 构型先被洗脱 。 B r u n n e r 等[, 8〕还用 (R ) - 1一 ( 1 一蔡基) 乙脉的 T L C C SP 分离五种2一 A P A 类药物的 N 一 ( 3 , 5 一二硝基苯基)酞胺对映体 , 展 开剂正己烧异丙醛 乙睛 (20 :8 :1 ) , 以分离布洛 芬 衍 生 物 R f 〔0.45 (R ) , 0 . 2 5 ( s ) ] 和 。 ( 2 . 1 0 ) 最高 , 其余4种 a 值均在1.65一 1.79之 间 。 用 al 一酸性糖蛋白 (A G P ) 和 各环糊精 (各 C D ) 键合微粒硅胶制成 C SP , 可不衍生直接分 离 2一 A P A 类药物对映体 。 A G P C S P 商品 名 E na nt io Pa c , 其溶质保留和立体选择性可用叔 胺如 N 一 N 一二甲基辛胺 (D M O A )加人流动相中 进行调节 。 用 E na nti opac 柱直接测定血浆 中布 洛芬 、 酮洛芬和非诺洛芬对映体浓度可供临床 手性药动学的研究[29 〕。 H au Pt 等[s0 〕用胶束色谱 和 A G P 柱的切换系统快速测定人肝微粒体内 的 S (+ )一和 R (一 )一蔡普生 。该法直接可将离心 后样品注射至 C 18 硅烷预柱 , 然后使保留分析 物 经 A G P 柱 分 离 , 流 动 相 含 30n m ol /L D M O A 和 40 9 /L 吐 温 20 的 磷 酸 盐 缓 冲 液 (pH 6. 5);加人表面活性剂既可降低保留时间 , 又能使生物样 品直接注人色谱系统成为可能 , 该法测定蔡普生对映体再现性好 , s ( + ) 一和 R (一 ) 一蔡普生的回收率分别为94 .9% 和99 .6 % 。 K e r n 〔, , 〕还用已商品化的第二代 e hiralA G p 柱 拆分蔡普生 , 流动相4m m ol /L 磷酸盐缓冲液 (pH 7.2) 一异丙醇 (99.5:0. 5) , a 可达 1.7 1 , 分 离时间小于sm in 。 无论柱稳定性 , 峰形状及分 离效果均优于 E nantiop ae 柱 。 各C D C SP 商品 名 C yc fo bond l , 用它测定生物体内布洛芬对映 体 , 流 动 相 0.1% 三 乙 胺 醋 酸 盐 缓 冲 液 (pH 7· 5 ) 一乙睛 (70 , 3 0 ) , 灵敏度0. 1拌g / m l[川 。 F a r k a s 等[3, 〕用排代色谱在 件C D 二氧化硅固定 相上直接制备性拆分布洛芬时发现 , 即使 。 为 1.08 , 仍可用排代和超载洗脱两种方式得到 良 好的制备性手性分离 , 装样量。. sm g 。 此外 , 最 近又发展了用人血清蛋白 (H SA )[s , 〕, a 一胰凝乳 蛋白酶 (a 一c H T ) [s4 〕和黄素蛋白 (一种鸡卵清糖 蛋白)[ss 〕制成的新型蛋白 C SP 直接拆分一些2- A PA 类药物 , 取得了较好结果 。其中用 H S A C S P 柱 H P I, C 分离蔡普生 、 布洛芬 、 非诺洛芬 、 舒洛芬 、 毗洛芬 (pirpro fen ) 等9种2一 A p A 类药 物对映体 , 流动相选用50 m m ol /L 磷酸盐缓冲 液 (pH 6.9) 一 乙睛 (85 , 1 5 ) 均可得到较高 a;除 了酮洛芬和 u3l 噪洛芬 (i ndo pro fe n) 在流动相 中 加人适量辛酸可缩短分析时间 , 使对映体达到 最适的分离 。 3 生物拆分法 近年来 , 随着生物技术和酶的发展 , 利 用微生物酶拆分得到了长足的进展 , 尤其将固 定化 、 多相反应 、 膜反应器和基因克隆等新技 术引人酶促反应系统使拆分更有效易行 , 为这 一方法展现了广阔的前景[36 ·37j 。 目前 , 生物法 拆分2一 A P A 类药物主要途径是以微生物酶立体 选择性水解 (醋、 酞胺和睛)、 醋化和芳烃氧化 。 最初 , 用酱油曲霉 (A spergillus sojoe) 与 含少量甲苯的 (士 ) 一蔡普生甲醋混合在水中搅 拌过夜得到无活性 R (一 ) 一蔡普生 , 「司尝- 55.5 。 , 收率16.3% [, , 〕。此后 , G u 〔3, 〕提出了一种 简便的用脂肪酶 (Li pase) 拆分制备 S (+ ) 一蔡 普生的方法 。 随之相继 出现用微生物胞外脂肪 酶 (EC 3. 1. 1. 3) 水解各种 (士 ) 一 2 一 A P A 醋 制备 S (+ ) 一 2 一 A P A 的报道 , 尤以 S (十 ) 一布 洛芬和 S (+ ) 一蔡普生为典型 。 Si h 咖〕指出具有 立体选择性水解 (士 ) 一 醋能力的胞外脂肪酶可 来源于假丝酵母 (Ca , di d a) 、 根霉 (R hi zoP u:) 、 毛 霉 (材“c o r ) 、 曲霉 (A sPergillus) 、 青 霉 (P enieill:‘m ) 、 假单胞菌 (P seudom 洲as) 、 色杆 菌 (C hrom oba cteri um )和地霉 (G eotri chum ) 属 的 微 生 物 , 尤 以 圆 柱 状 假 丝 酵 母 (C. 卿lin d ra cea ) 脂肪酶 (简称 e e L )[“ 〕为佳 。 用 C C L 水解 (士 ) 一蔡普生 甲醋或氯乙醋得到 S (+ ) 一蔡普生 , 收率分别为25.2% 和 40.0 % , [ a 贸 + 65.00和 + 6 4.2。 。用 C C L 水解 (士 ) 一布 洛芬乙氧甲酞甲酷或丙炔醋可得到 S (+ ) 一布 洛芬 , 转化率 (G L C ) 分别为45 % 和40 % , 相 应 [司罗+ 55 .50 和 + 54 .9。 , 也可直接用 圆柱状 假丝酵母 A T C C 14830水解 (士 ) 一布洛芬乙氧 甲酞甲醋得到 S (+ ) 一布洛芬〔倒 。将C C L 固定 地吸附在弱极性 A m ber lit e X A D 一 7 树脂上 , 用 年 22(2) 徽 生 物 学 通 报 50 0m l 柱式反应器水解 (士 ) 一蔡普生 乙氧乙酷 , 连续操作1200h 得到 1.skg s (+ ) 一蔡普生 , e e > 95 % , 收率25 % , 酶活力经12o0h 使用损失约 20 % 阳〕。近来 , 开发利用多相萃取酶膜生物反 应器的新技术从消旋体或潜手性化合物中选择 产生光学纯对映体格外引人注目。 M at so n [’月等 用萃取膜反应器将 C CL 或米曲霉 (A. ory za 。) 产蛋白酶 (pro tea se) 固定化在微孔超滤膜上立 体选择性水解多种亲水和疏水的 (士 ) 一蔡普生 醋或 (士 ) 一布洛芬醋得到相应的 S (+ ) 一或 R (一 ) 一酸 ;而用 C C L 中空纤维超滤膜多相萃取 反应器连续水解 (士 ) 一禁普生甲酷或 (士 ) 一布 洛芬三氟乙醋分别得到光学纯 S (+ ) 一酸 。 采用 这一新技术既可提高酶促反应能力 , 又可改善 选择性分离弱水溶性光学对映体 , 同时还实现 产物与底物的分离 。 最近 , 研究用微生物酶立体选择性进行酷 水解逆反应— 醋合成拆分布洛芬已见报道 。用 c c L 在正 己烷中醋化 (士 ) 一布洛芬和戊醇反 应得到 S (+ ) 一布洛芬戊醋 , ee > 99 % , 收率 42 % 。发现醋化收率伯醇高于仲醇 , 叔醇不发生 醋化;酶的醋化活性与溶剂 Log P (P 为化合物 在辛醇/水两相体系中分配系数)有 良好的相关 性 , C C L 仅在正 己烷 、 庚烷 、 异辛烷和癸烷等 强疏水溶剂中显示高的催化活性 ; 醋化活性与 立体选择性还受反应混合物中水含量的影响极 大 , 随着水的增多明显减弱嘟〕。另有用 C C L 在 油包水的微乳液 (A O T /异辛烷) 中 , 进 行 (士 ) 一布洛芬和丙醇的醋化反应 , 其立体选择性 比率 (E ) > 150 , 转化率32% , 得到 S (+ ) - 布洛芬丙酷 ee 100 % ; 该 C C L 的高度立体选择 性仅出现在微乳剂体系中 , 而在单纯有机溶剂 体系 (异辛烷) 醋合成 (E 3.o , 转化率41 % ) 或 在含水体系 (缓冲液)水解 (E l.3 , 转化率32 % ) 均无获得 。 作者认为 , 酶在不同体系中立体选择 性差异主要归因于界面现象.在微乳剂体系中 由于表面活性剂分子形成反相微胶层使溶解酶 的水与溶解底物的溶剂分隔开产生相对大面积 的界面 , 而在纯有机溶剂体系 (无表面活性 剂) 及含水体系中不存在此界面 , 其作用机理 尚待进一步研究嘟〕。 另有制备 R (一 ) 一布洛芬的生物法 , 其中 以用蜡状芽抱杆菌 (B acillus cere us) 、 胶醋酸杆 菌 (A cetobacter 卿linum ) 和金黄色葡萄球菌 (StaP 勺loc occus aure us) 立体选择性水解为最 佳 。 除了直接用微生物 、 固定化细胞和醋酶外 , 还可由分离出相应的具有立体选择性水解蛋白 质基因译码完成阳 〕。 我们在拆分布洛芬研究中 也发现 , 芽抱杆菌 、 醋酸杆菌和假单胞菌属 的 一 些菌能优先水解 (士 ) 一布洛芬 乙醋中 R (一 ) 一构型为 R (一 ) 一布洛芬 , 生成量1.6一 2 · 7g / L , ee 约85 写沁〕。但芽抱杆菌属中泰国芽 抱杆 菌 (B . thal’) 、 地 衣 形 芽抱杆 菌 (B. lichenlfo rm is); 短杆菌 (B re vibaeteri um ) 属 中 乙酞短杆菌 (B . acety licum ) 、 蛾短杆菌 (B . imP eri al ‘ ) 和 假 单 胞 菌 、 枝 动 杆 菌 。毛夕‘OP l a n a ) 、 小球菌 (Mi croc oc cus) 等属的一 些不 定名种水解 (士 ) 一 2 一A P A 醋均得到 S (+ ) 一酸[49 一5, 〕。 近来 , 又提出了一种颇有吸引力 的用选择性酶水解 (士 ) 一 2 一 A P A 类药物如蔡普 生 、 布洛芬和 氟 比洛芬的醋制备高纯度 S (+ ) 一酸的方法 。 即通过梭酸醋酶 N P 基因克隆 到枯草芽抱杆菌 (B . su bt ili 、) 1 一 85 上表达 , 使 该酶获得高产率且完全消除存在于野生菌株中 非专一性脂肪酶的不利影响 , 从而提高酶的立 体选择性 ; 可制备 ee ) 98 % 的 S (+ ) 一蔡普生 或 S (+ ) 一布洛芬 ; 该酶的稳定性用 甲醛 、 戊 二醛或 乙二醛进行化学修饰可 得到显著提 高[, , ] 。 我们在拆分布洛芬的研究中 , 筛选到一株 几乎无脂肪酶活力 , 但能高度立体选择性水解 (士 ) 布洛芬醋为 S (+ ) 一布洛芬的酵母菌 T 158 , 鉴定为皮状丝抱酵母 (T ri cho sP 。~ c ut a n e u m ) 。 它可水解 (士 ) 一布洛芬乙醋得到 S (+ ) 一布洛芬 , [ a 工+ 55.2。 , e e 妻93 % (H p L C - C S P ) , 收率31 .5% ;而水解 (士 ) 一布洛芬甲醋 或异丙酷 ee ) 97 写; 该酵母竣酸醋酶存在于细 胞内 , 收获细胞经冷冻丙酮处理后得到的干粉 在含 D M F 的水溶液中可明显提高水解乙醋的 立体选择性〔‘8 , 5 3 〕。 微 生 物 学 通 报 1995年 22(2) 90 年代以来 , 利用微生物酶立体选择性水 解睛类 (或酞胺 ) 制备光学活性2一 A P A 己为许 多研究者所关注 , 逐渐成为新的研究热点 。酶法 立体选择性转化 (士 ) 一 2 一芳 基丙 睛 (2一 A P - C N ) 为 S (+ ) 一 2 一 A P A 主要存在两种途径 。 一 是用睛水解酶 (n itril ase)直接水解 (士 ) 一 2 一 A P - C N 为 S (+ ) 一 2 一 A P A ; 另一条是用睛水合酶 (nitrile hy dratase)和酞胺酶 (am idase )相结合 转化 (士 ) 一 2 一 A P 一 C N 为 S (+ ) 一 2 一 A P A , 2 一芳 基丙酞胺 ( 2一 A P 一 C O N H Z ) 为中间产物 。 上述三 种睛降解酶可来源于红球菌 (R ho doc oc ous )、 不 动杆 菌 (八cin eto占a cte r ) 、 短 杆菌 或分 枝杆 菌 (似乡cobacterium ) 等属微生物 (另文详述)仁5‘] 。 此外 , S ( + ) 一 2 一 A P A 还可用微生物酶立 体选择性氧化芳烃制备 。起初 , 用红球菌氧化1- 异丁基一 4 一 (1 一甲基辛基) 苯得到的 R (一 ) 一布 洛芬 , [ a 猎一 4 4 . 2 。 , 收率17. 4% [55」。此后 , 发现 蛹虫草 (Co rdy ce Ps m ili tari 、) 氧化2一 ( 6 一 甲氧基 一 2 一蔡基) 丙烷为 S (+ ) 一蔡普生 , ee 97 . 8 % ; 氧 化2一 (4 一异丁基苯基 ) 丙烷为 S (十 ) 一布洛芬 , e e s o % 〔56〕. 而 用 E x oP hia la , G r a P h i u m 和 尺人in o eza 、i: z za 三个属霉菌氧化 2一 ( 6 一 甲氧基- 2一蔡基) 戊烷 、 庚烷或壬烷得到 S (+ ) 一蔡普 生 , 其中一株 E .Jeanselm ei变种转化2一 ( 6 一 甲氧 基2一蔡基 ) 戊 烷可得 到 光 学 纯度 10 0% 的 S (+ ) 一蔡普生[5,〕。 综上所述 , 化学法拆分过程一般冗长 , 需 要昂贵的手性试剂 , 且多数情况下较难得到满 意的收率 。 色谱法分离对映体具有快速 、 准确 、 灵敏度高等特点 , 但因需用 C S P 、 添加 C M P 或 用手性试剂衍生化 , 常局限于常规或生物样品 的分析和进行小规模制备 。 生物法拆分因立体 选择性强 , 反应条件温和 , 程序简便 , 成本低 等优点 , 显示 出诱人的前景 。 参 考 文 献 仁1 」 仁2 」 仁3 ] E vans A M . E ur J C l一n P h a r m a e o l . 1 9 9 2 . 4 2 : 2 3 7 2 5 6 . H a r r is o n I T , L e w l s B , N e x s o n P e t a l M e d C h e m . 1 9 7 0 A d 1 3 : 2 0 3 一205. am s 5 5 , B r e s l o f f P , M a s o n C G . J P h a r m 匕 4 口 [ 5 ] [ 6 口 〔7 ] [ 8 ] [ g j 仁10〕 [11〕 [12〕 [13〕 [14〕 [1s j [16〕 [17〕 [18」 [19〕 [20」 [2 1」 [22」 [23] [24〕 [25口 [26口 [27] [28口 Pharnlaeol, 1 9 7 6 , 2 8 : 2 5 6 一257. R ulozr A , K n a d l e r M P , H o P P K e z a l . J P h a r m S e l , 1 9 8 5 , 7 4 : 8 2 一84. W eehter W J , I o u g h h e a d D G , R e 一s e h e r R J e z a l . B lo e h e m B zo p h y s R e s C o m m . 1 9 7 4 , 6 1 : 8 3 3 一837. H utt A J . C aldw ellJ. J P 飞。 :、 F I : a r m a e o l , 1 9 8 3 , 3 5 : 6 9 3 一704. Jam al一 F , M e h v a r R , P a 、 、1 , [ ) F 入诬. J P h ar m S el. 1 98 9 , 7 8 : 6 9 5 一7 15. B rune K , G e 一s s l zn g e r G , M e n z e l 一 S o g l o w e k 5 . J C I‘n P h a r m a e o l . 1 9 9 2 , 3 2 : 9 4 4 一952. 0 1一a r y J , T o d M , N l e o l a s P e z a l . B ; o p h a r m D r u g D l s P o s , 1 9 9 2 , 1 3 : 3 3 7 一344 , 黄胜炎. 药学进展 , 1 9 9 2 , 1 6 : 1 1 7 一122 · E t h y l C o r p . S e r l p N o 1 6 2 3 , 1 9 9 1 , 2 5 ; S ( + ) 一 I b u p r o f e n a T e e h n i e a l S u m m a r y , F e b 1 1 9 9 3 . N i e h o l s o n J S , T a n t u m J G . U 5 P a t , 1 9 8 0 , 4 2 0 9 6 3 8 . 贾春荣 , 乐嘉赓.中国医药工业杂志 , 1 9 9 。, 21 : 1 37 一 140. K alser D G , V a n g l s s e n G J , R e i s e h e r R J e t a l . J P h a r m S e l , 1 9 7 6 , 6 5 : 2 6 9 一 273. 张霖泽 , 劳肇经 , 黄绍悦 , 等. 医药工业 , 1 9 85 , 1 6: 1 4 5 一147. L arsen R D , C o r l e y E G , D a v 1S P e t a l . J A m C h e rn S o e , 1 9 8 9 , 1 1 1 : 7 6 5 0 一7651. P 一e e o l o o , S p r e a f l e o F , V l s e n t i n G e t a l . J O r g C h e m , 1 9 8 7 . 5 2 : 1 0 一 1 4 . R a j a n B a b u T V , C a s a l n u o v o A L . J A rn C h e m S o e , 1 9 9 2 , 1 1 4 : 6 2 6 5 一 6266. G oto J , G o t o N , N a m b a r a T . J C h r o m a t o g r . 1 9 8 2 , 2 3 9 : 5 5 9 一 564. B lessington B .C rabb N , K a r k e e S . J C h r o m a t o g r , 1 9 8 9 , 4 6 9 : 1 8 3 一 190. C hen C 一S , C h e n T , S h x e h W R . B i o e h 一m B lo p h y s A e t a . 1 9 9 0 , 1 0 3 3 : 1 一 6. M altre J M .BO ss G , T e s t a B e t a l . J C h r o m a t o g r , 1 9 8 6 , 3 5 6 : 3 4 1 一345. 尤田耙 , 手性化合物 的现代研究方法 , 合肥 : 中国科 学技术大学出版社. 199 3, 83 一 113 · 徐诗伟 , 徐 清.曹桂芳等. 微生物学通报 , 1 9 93 , 20 : 3 7 1 一374- G asparrinl F , M i s l t 1 D , V i l l a n l C ￡ t a l. J C h r o m a to g r , 1 9 9 3 , 6 3 3 : 8 1 一87. Plrkle W H . P oehapsky T C , M a h l e r G S 召t a l . J O r g C h e m , 1 9 8 6 , 5 1 : 4 9 9 1 一 5 0 0 0 . K e rn J R . J C h r o m a to g r , 1 9 9 1 , 5 4 3 : 3 5 5 一366. B run ner C A , W a l n e r 1 . J C h r o m a t o g r , 1 9 8 9 , 4 7 2 : 年 22(2) 微 生 物 学 通 报 101 仁29习 [44〕 [45」 [30〕 [ 46〕 [31」 〔32」 [48」 [ 34」 [49〕 仁50〕 刁JJ曰, 月孟Q妇匕J口叹厂IJ厂L[ 3 5 〕 〔36〕 〔37〕 [ 38」 [53 ] [ 39] 〔54〕 〔55」 〔40口 [41〕 [56口 [ 57] [42〕 仁43) 277一2 83. M enzel一 S o g l o w e k S , G e i s s l 一n g e r G . B r u n e K . J C h r o m a t o g r , 1 9 9 0 , 5 3 2 : 2 9 5 一303. H auP t D , P e t t e r s s o n C , W e s t e r l u n d D . J B l o e h e m B i o P h y s M e t h o d s , 1 9 9 2 , 2 5 : 2 7 3 一 28 4. G eisslinger G , D i e t z e l K . J C h r o m a t o g r , 1 9 8 9 , 4 9 1 : 1 3 9 一14 9. F arkas G , I r g e n s L H , Q u i n t e r o G e t a l . J C h r o m a t o g r , 1 9 9 3 , 6 4 5 : 6 7 一 74 . N o etor T A G , F e l i x G , W a i n e r 1 W . C h r o m a t o g r a p h 一a . 1 9 9 1 , 3 1 : 5 5 一59. M arle l , K a r l s s o n A , P e t r e r s s o n C . J C h r o m a t o g r . 1 9 9 2 , 6 0 4 : 1 8 5 一196. M ano N , O d a Y , A s a k a w a N e t a l . J C h r o m a t o g r , 1 9 9 2 , 6 2 3 : 2 2 1 一228. Santaniello E , F e r r a b o s e h i P , G r i s e n t l P e t a l . C h e m R e v , 1 9 9 2 , 9 2 : 1 0 7 1 一1140. 徐诗伟 , 徐 清. 微生物学通报 , 1 9 9 3 , 20 : 23 2 一237 · I r i u e h i j i m a S , K e i y u A . A g r l e B i o l C h e m , 1 9 8 1 . 4 5 : 1 3 8 9 一 1392. G u Q 一 M , C h e n C 一 5 . S i h C J . T e r r a h e d r o n L e r t . 1 9 8 6 . 2 7 : 1 7 6 3 一1766. 5 lh C J. E ur P at , 1 9 8 7 , 0 2 2 7 0 7 8 . T o rn i z u k a N , O t a Y , Y a m a d a K . A g r i e B 一0 1 C h e m . 1 9 6 6 , 3 0 : 5 7 6 一 584. C esti P , P 一e e a r d l P . E u r P a t , 1 9 8 6 , 0 1 9 5 7 1 7 . Ba t t i s t e l E , B i a n e h z D . C e s t i P ‘r a l . B 一o te e h n o l B lo e n g , 1 9 9 1 , 3 8 : 6 5 9 一 664. M atson 5 L . U 5 P at , 1 9 8 9 , 4 8 0 0 1 6 2 ; 1 9 9 1 , 5 0 7 7 2 1 7 . M u s t r a n t a A . A P P I M 一e r o b io l B i o t e e h n o l , 1 9 9 2 , 3 8 : 6 1 一66. H edstrom G , B a e k l u n d M , S l o t t e J P . B i o t e e h n o l B 一o e n g , 1 9 9 3 , 4 2 : 6 1 8 一 624 . Be rtola M A , D e s m e t M J , M a r x A F e t a l . E u r P a t , 1 9 8 9 , 0 2 9 9 5 5 8 . 徐诗伟 , 曹桂芳 , 徐 清 , 等. 微生物学报 , 1 9 95 , 35 : 待发表. G ist一B r o e a d e s N V . J P , 1 9 8 8 , 6 3 一 45234. W atanabe l , H o s o l A , K o b a y a s h i E . J P , 1 9 8 8 , 6 3 一 63396. B attistelE , B i a n e h i D . C e s t l P e t a l . E r u P a t , 1 9 9 2 , 0 5 1 0 7 1 2 . M u t s a e r s J H G M , K o o r e m a n H J . R e e l T r a v C h l m P a y s 一 B a s , 1 9 9 1 . 1 1 0 : 1 8 5 一188. 徐诗伟 , 徐 清 , 曹桂芳 .等. 微生物学报 , 19 95 , 35 : 待发表. 徐诗伟 , 徐 清 · 微生物学通报 , 1 9 9 5 , 22 : 待发表. S ugalT , M o r i K . A g r 一e B xo l C h e m , 1 9 8 4 , 4 8 : 2 5 0 1 一 2504. P hlll一P s G T , R o b e r t s o n B W , W a t t s P D e t a l . E u r P a t , 1 9 8 6 , 0 2 0 5 2 1 5 . Be r t o l a M A . M a r x A F , K o g e r H 5 e t a l . E u r P a r , 1 9 8 8 . 0 2 7 4 1 4 6 . ( 上接封三 ) 8一 12日 细胞色素 P 45 O生物多样性会议 , 美国 伍兹霍尔 汉诺威95 年生物工程学会议 , 德国汉 诺威 国际生物湿法冶金会议 , 智利尼亚德 尔玛 19一 2 3 日 26一 29 日 10一12日 发展中国家病毒学会议 , 埃及开罗 固定化细胞:基础和应用讨论会 , 荷兰 诺德威克豪特 11月 19一22日 (昊 明 门大鹏)