2－遗传性出血病的临床检测和基因诊断(王鸿利）

null遗传性出血病临床检测和基因诊断遗传性出血病临床检测和基因诊断上海交通大学医学院附属瑞金医院 王鸿利 2007.4研究对象研究对象 1 遗传性出血病的研究技术平台技术平台 建立技术平台 临床表现→家系调查 表型检测 基因诊断 突变基因的功能研究 携带者和产前诊断null家系资料实验表型基因诊断临床资料体外表达研究临床诊断 临床治疗诊断和治疗临床表现 以广泛出血为临床特征临床表现 以广泛出血为临床特征血友病的出血特征 大关节 肌肉 皮肤 粘膜 内脏 创伤 手术临床表现 以广泛出血为临床特征临床表现 以广泛出血为临床特征其他出血病的出血特征： 皮肤瘀斑 粘膜（鼻、口腔）出血 月经过多，持续时间长 内脏出血 创伤出血/手术出血难止家系调查家系调查性连锁隐性遗传 例如血友病A/B等家系调查家系调查常染色体隐性遗传（AR)例如FII、V、VII、X、XI、XII、XIII缺乏症等家系调查家系调查常染色体显性遗传(AD)例如，毛细血管扩张症、异常纤维蛋白原血症、部分VWDnull表型诊断－一期止血缺陷 筛选试验null表型检测－一期止血缺陷 诊断试验null表型诊断－二期止血 筛选试验null表型诊断－二期止血 诊断试验表型检测－VWD的检测表型检测－VWD的检测VWD实验诊断和分型流程VWD实验诊断和分型流程null 在人类基因库中寻找相关的基因序列PCR扩增PCR产物的纯化 RFLP基因诊断直接测序TA克隆RT-PCR、AS-PCR、Realtime PCR技术平台－遗传性出血病的基因诊断例如血友病A-内含子22倒位（占47－48％）例如血友病A-内含子22倒位（占47－48％）null血友病A-内含子1倒位血友病A－其他突变的检测血友病A－其他突变的检测 血友病A-非内含子22/内含子1倒位 间接连锁：9个多态性位点 直接基因测序例如：遗传性凝血因子VII缺陷症例如：遗传性凝血因子VII缺陷症F7基因图 Arg304Trpnormal10966-8delCnull5例遗传性凝血因子VII缺陷症实验表型及基因检测结果国际首次报道的基因突变国际首次报道的基因突变vWF基因大片段缺失致病的分子基础vWF基因大片段缺失致病的分子基础 1.8kb缺失＝63－1.8=约61kbvWF基因大片段缺失致病的分子基础vWF基因大片段缺失致病的分子基础 1.8kb缺失＝63－1.8=约61kbvWF大片断缺失致病的分子基础vWF大片断缺失致病的分子基础 发夹结构Blood cell, molecules, and Diseases (in press)2006国际上首次综合运用多种in silico（复杂性、重组相关元件和核基质结合区)分析1个3型vWD 患者的vWF基因大片段缺失分子基础null 转染真核细胞生物代谢标记活性与抗原检测免疫荧光染色Western印迹定量 PCR构建突变基因cDNA的表达载体突变基因功能研究null国际首报14种突变基因致病的分子基础 血友病携带者和产前诊断传统 采集羊水血友病携带者和产前诊断血友病携带者和产前诊断 PCR扩增外周血DNA抽提（携带者）直接核酸测析间接联锁分析明确诊断长链PCR检测内含子1,22倒位血友病A ①、 ② 、③羊水DNA抽提（胎儿）①③②血友病A间接连锁分析血友病A间接连锁分析 国外多采用2个STR （CA13、CA22）及2个SNPs （BcI I、Hind Ⅲ），诊断率约为80％（Hemophilia. Chapman & Hall, London , 63-74 ） 这些位点在中国仅1/3有遗传信息(Clin Chem Lab Med 2001;39(12):1204~1208 )血友病A间接连锁分析血友病A间接连锁分析 F8CF8Civs13 G6PDDXS9901DXS15DXS1108DXS1073DXS52F8Civs22 BclI 性别基因位点联合9个多态性位点及性别基因位点，累积识别能力99.6% 建立7重荧光PCR技术 诊断率和准确率均为100％null欧美国家利用F9基因内的6个多态性位点，可对89％的血友病B作出诊断（Br J Haemato1 1993．84：101-105) 亚洲人这些位点的诊断信息几乎为0（Hum Hered. 1992;42(3):204-5）血友病B间接连锁分析null寻找杂合度较高的F9基因外的6个STR位点，累积识别能力为99.99％ 本项目的诊断率和准确率均为100％血友病B间接连锁分析DXS1192 DXS1211 DXS102 DXS8013 F9 DXS1227 DXS8094 血友病A/B携带者和产前诊断结果血友病A/B携带者和产前诊断结果血友病A/B携带者和产前诊断结果血友病A/B携带者和产前诊断结果目前，以4～6个家系/月，接收来自全国及海外的血友病携带者和产前诊断时瑞杰null 基因诊断 FISH PCR正确的基因诊断遗传咨询植入正常的胚胎取1-2单卵裂球血友病单细胞植入前诊断辅助生殖中心基因诊断中心 null谢 谢!