中国动物检疫 2007年第24卷第4期
伪狂犬病(pseudorabies,PR)是
猪疱疹病毒Ⅰ型引起的一种多种家
畜感染得的急性传染病。其特征为
发热、奇痒及脑脊髓炎.可引起妊娠
母猪繁殖障碍、流产、死胎、呼吸症
状。新生仔猪除出现神经症状外还
可侵害消化系统。临床症状主要
现为腹泻、呕吐、生长不良等。在自
然条件下猪、牛、绵羊、犬、猫、兔、鼠
等及多种野生动物都能发生感染。
试验结果证实猪和鼠类是自然界中
病毒的主要贮存宿主,也是引起其
他家畜发病的疫源动物。猪既是本
病原的原发感染宿主,又是病毒的
长期贮存者和排毒者,在伪狂犬病
的传播上起着重要作用。河南某猪
场发生临床症状相似的传染病。从
病猪脑部采集病料,对病毒进行分
离鉴定。
1 材料与
1.1 试验材料 可疑病料采自河
南某猪场病猪脑部,PRV阳性血清,
PRV阴性血清和 PRV
强毒株
(闽A株)均由郑州牧专中心试验室
保存。PK-15细胞由郑州牧专中心
试验室保存。
1.2 试验试剂 明胶、DMFM自购
J-Sigma公司,新生犊牛血清购自杭
州四季青生物工程材料研究所。
1.3 病料处理 无菌取病猪脑部与
PBS(0.1M,pH7.2)以 V/V1:5制成
一例猪伪狂犬病毒分离和鉴定
韩 勇 1,2) 李文刚 1,3)* 项朝荣 1) 高卫科 1) 王 鑫 1) 魏娟 1)
(1河南农业大学 郑州 450002 2日照市畜牧局 2768003郑州牧专 450011)
*通讯作者
通讯地址:郑州牧业高等专科学校科研处
2.3 染色镜检结果:49份可疑细菌
均为革兰氏阳性小杆菌,大小为
0.4-0.5μm×0.5-2.0μm;在油镜下
观察,49份可疑细菌均出现轻微旋
转或翻滚样的运动。
2.4 生化试验:分离出的 49份可
疑细菌分别在 SIM培养基上有动
力、不产硫化氢;在TSI琼脂上底层
和斜面产酸,不产硫化氢;在羊血琼
脂平板上产生窄小透明的 β型溶
血环,其它生化结果见下表,均与单
核增生李斯特氏菌标准株生化试验
结果一致。
2.5 协同溶血试验:靠近金黄色葡
萄球菌接种点的 49份可疑细菌溶
血均增强,与单核增生李斯特氏菌
标准株试验结果一致。
3 讨论
3.1 李斯特氏菌的检测方法主要有
细菌分离、血清学检测、ELISA技术、
基因探针技术、PCR技术等。原来我
局使用国家标准检测单增李斯特氏
菌,至少需要4d才能完成检验。2004
我局用商品化的Reveal李斯特氏菌
快速检测试剂盒,进行单增李斯特氏
菌检测。该试剂盒利用侧流式免疫色
谱
技术,可快速检测食品及环境
样品单增李斯特氏菌,检测和初步鉴
定可在43h内完成。该试剂盒特异
性强,对任何其它微生物反应均未发
现有交叉反应。该方法已经通过
AOAC认证(RI#960701),敏感性为
1-25CFU/25g样品。
从 2004年 8月我局开始使用
该方法,到 2006年底为止,共检样
1523批,经过 Reveal李斯特氏菌
快速检测试剂盒初筛、初筛出 61
批;然后在显色培养基上分离细菌,
最后确认检出单增李斯特氏菌 49
批,其生化反应结果及协同溶血试
验结果,均与单核增生李斯特氏菌
标准株试验结果一致,符合单增李
斯特氏菌的特征,因此确定分离的
可疑细菌就是单增李斯特氏菌。初
筛出61批,最后确认检出单增李斯
特氏菌49批,准确率达80.3%。
根据国家质量监督检验检疫总
局第26号令《进出境肉类产品检验
检疫办法》的规定,目前对单增李斯
特氏菌只需要进行监测性检验。从
2004年 8月到 2006年底为止,我
局共检样1523批,检出单增李斯特
氏菌49批,阳性率达3.2%,存在一
定风险。为了严防有害有毒物质进
境,切实保护我国消费者身体健康
和公共卫生安全,以后有必要进一
步加强进口肉类产品单增李斯特氏
菌的检验。
3.2 该方法比较简单,主要使用常
规仪器。基层实验室使用该办法也
不需要购买新的仪器,对基层实验
室比较实用。但在使用中,需要严格
按照实验规程进行操作,否则会影
响检测结果的准确性。此外,基层实
验室分离鉴定的单核增生李斯特氏
菌,最好送上级实验室或参考实验
室复核,防止将李斯特氏菌属其它
细菌鉴定为单核增生李斯特氏菌,
避免出现假阳性结果。
3.3 一般标准方法都推荐使用选
择性培养基。本实验直接使用显色
培养基,选择性强,平板上的菌落特
征更明显更容易识别,对快速检测
比较适用。但缺点是成本比较高。
参考文献(略)
文章编号:1005-944X(2007)04-0040-02
防检技术
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中国动物检疫 2007年第24卷第4期
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匀浆,反复冻融3次,3000r/min离
心15min,取上清中加双抗,37℃作
用18h;经0.45um滤膜除菌。
1.4 小鼠接种试验 取 10只 8周
龄 Balb/c小鼠,其中 4只腹腔注射
病料滤液0.2ml/只,另4只背部脊
柱附近皮下注射病料滤液 0.2ml/
只。接种后观察小鼠的采食、饮水、
精神状况及临床表现。
1.5 细胞接种试验 接种 0.5ml
病毒滤液于长成单层的细胞。连续
观察,直到出现细胞病变(CPE)。
1.6 分离毒的毒价 滴定 PK-15
细胞培养于96孔细胞板上,待细胞
生长成单层。分离病毒作10倍系列
稀释(病毒浓度为10-1-10-10).每个稀
释度接种 8孔.每孔 0.1ml,第 11,
12列为空白对照。记录各个梯度的
病变数,连续观察5d。参照杜念兴
主编《兽医免疫学》[1]中的 Karber法
计算出分离毒的TCID50。
1.7 微量中和试验鉴定分离毒 (固
定病毒稀释血清法) 将 PRV阴性
血清和阳性血清分别进行 10倍系
列稀释 (血清浓度为 10-1-10-10),加
等 量 的 200TCID50,37℃感 作 20
min。分别接种96孔板单层PK-15
细胞,每孔0.1m1,每个稀释度接种
8孔,第11列为空白对照,第 12列
为标准强毒株对照(200TCID50)。记
录各个梯度的细胞病变数,连续观
察5d。同时设标准强毒株(闽A株)
与阳性血清及标准强毒株(闽 A株)
与阴性血清对照。方法同上。
1.8 引物
根据基因库的
PRV gE基因设计 1对引物鉴定
该病毒。
Prv
上游引物:5'-agtactcgcaggggc
gcaact-3’下游引物 3'-tgtgga
tgtggttctagccgc-5'
1.9 聚合酶链式反应(PCR) 将病
毒接种PK-15细胞。当细胞病变达
80%以上时收集细胞,用常规方法提
取病毒DNA[2],用TE溶液溶解沉淀,
分装备用-70℃冻存 (殷震等.1997)。
按照宝生物工程(大连)有限公司LA
PCR试剂盒说明进行扩增.反应程序:
94℃5min,94℃ 1min,55℃1min,
72℃1min,共进行30个循环。72℃
10min,最后取PCR产物在1%琼脂
糖凝胶上电泳鉴定。
2 结果与分析
2.1 小鼠接种试验 小鼠接种病
料12h后,.表现打堆,不爱活动,其
中1只小鼠出现后肢麻痹,可能是
病毒侵入神经引起麻痹;48h后 2
只小鼠出现被毛逆立;60h后 3只
小鼠死亡,直到72h共死亡6只。
2.2 细胞病变的观察 PH-15细
胞接种病料12h后出现空洞,细胞
变圆,第 24h出现明显的拉网病
变,48h细胞脱落。
2.3 分离毒的毒价滴定 不同稀
释度的病毒在 96孔细胞板 PK-15
细胞单层出现的CPE。结果见下表,
经统计细胞病变.参照以下公式
TCID50=1,+d(S-0.5)[3]
计算该病毒在Vero细胞培养
物的毒价为10-9.45/0.1ml。
2.4 微 量 中 和 试 验 结 果 分 析
PRV阳性血清特异中和分离毒,抑
制细胞病变,说明所分离的病毒是
伪狂犬病毒。
2.5 PCR反应结果分析 琼脂糖
凝胶电泳鉴定结果表明,扩增出的
片段大小约为370bp,与预期长度
相符。图1。
3 讨论
分离伪狂犬病毒可以将采集的
样品匀浆接种易感细胞加以增殖,
通过特异性抗血清中和试验检测特
异性细胞病变加以鉴定,还可以用
PCR来鉴定。作者从急性死亡病猪
脑部分离出的病毒,经过动物接种
试验、细胞接种试验及对其毒价进
行滴定初步判断其为伪狂犬病毒;
经中和试验 PRV阳性血清能够特
异中和分离毒,抑制细胞病变;根据
PRVgE基因设计的引物对分离毒
DNA进行 PCR反应,可扩增出特
异性条带。以上结果可鉴定分离毒
为伪狂犬病毒。
参考文献
1.杜念兴.兽医免疫学,北京:中国农
业出版社,1995.
2.殷震,等.动物病毒学,北京:科学
出版社,1997:988-1009
3.范伟兴,等.中国顶防兽医学报,
2003,25(4):294-298.
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防检技术
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