马尔尼菲青霉菌溶血磷脂酶基因的识别和序列分析及功能预测

马尔尼菲青霉菌溶血磷脂酶基因的识别 和序列分析及功能预测 李凌华胡凤玉 陈万山 宋伟南蔡卫平唐小平 【摘要】 目的从马尔尼菲青霉菌(PM)酵母相全长cDNA文库中识别溶血磷脂酶基因，预测其结构 和功能，为进一步实验研究提供理论依据。 利用NCm在线分析工具对PM酵母相全长cDNA文库进 行筛选，识别溶血磷脂酶基因；通过v∞研N11鲥te8．O软件包，对其编码蛋白质的各种结构与功能特征进 行预测，并构建种系分子进化树。结果筛选得到韵基因长1014bp，Blasb【分析该基因可能是编码PM溶血 磷脂酶的全长基因，完整的开放读码框(啪’)共含729bp，编码243个氨基酸；其编码蛋白的相对分子质量 为26800，预测等电点为5．49，疏水氨基酸占47．7％，亲水氨基酸占26．8％，酸性氨基酸占12．7％，碱性氨 基酸占12．8％；该蛋白有潜在的2个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、3个蛋白激酶c磷酸化位点和7个N．肉豆 蔻酰位点。结论该氨基酸序列属于溶血磷脂酶样功能域特征蛋白酶；与球孢子菌亲源关系最近。通过研 究，一个PM溶血磷脂酶基因被成功发现，这为进一步探讨该基因的功能提供了条件。 【关键词】溶血磷脂酶；马尔尼菲青霉菌；生物信息学 MleI诏商Ⅻ咖and辩叩脚锄mIy!盘删如H舳I—胃艋咖of曲e窖峨a骘硼ing啊鲫—的叩hm肼-辩‰躺黝蛳廿姗妇，删晚弘。删‰妇，觥肱黼，伽眦咖，粼胁廊．及舯删旷卅施洳历踟溺，妇躺脚’5肋即删锄删幻岛帆咖‘胍池础嘶，仇明鲥眦 5J∞6D．a西硷 Q雕私慨加：7MG蕊睁加w，易，，蒯：痂叼砌班”孵@廊．姗 【Abs嘣】0bj硎靶Toi如I嘶岫ge嘴enoodirIgly棚hoIip啪丘响t11e叫lell雩曲cDNAlibIary0f Pe越谢玩阱m忉嘲阮(PM)iny∞st妞arIdp础cttllestnlctIlmalldm眦tion0fi协deduced硼咖irI，t0胛砌dew汕 Ⅱ嘲硎calevide蝴for矗耐埘唧响唧lts．陆n的凼，nle刚fIIll一嘶hcDNAlibraryirIy咄tplla∞w鼬靶脱lled协 icIerIti母岫ge∞e呻0dillgly鲫I炯洲ipa∞witIltlleIlelp0fNcmor卜lir屺a一如c砒t001．’胁l，by砸li五ng她sof晰牝 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作者单位：510060广州医学院附属市八人民医院感染病科 通信作者：唐小平，Bmail：xia叩岫≠锄g睁@yaI-∞．嗍 垦匿煎筮瘟堂篮垫瘟堂盘查垫!!堡垒旦筮塑鲞箜2塑匦』量然塾幽迪塑堕：蜓!垫!!：型：垫：№：2 马尔尼菲青霉菌(PM)是我国南方地区艾滋病 患者重要的机会性致病真菌¨引。该菌具有强侵袭 力，经呼吸道、消化道或皮肤破损进人人体后，主要 侵犯单核．巨噬细胞系统而引起播散性感染[3|。若 患者没有获得及时的诊断和治疗，死亡率极高。迄 今为止，有关PM的致病机制，国内外研究甚少。最 近研究发现，溶血磷脂酶参与真菌分解宿主细胞膜 磷脂，可引起宿主细胞膜的通透性增高和完整性受 损，从而促进真菌的侵入，在其感染早期发挥重要作 用[矧。因此，研究溶血磷脂酶基因及其编码的蛋 白，有望成为研究PM致病机制的重要切入点。我 们已成功构建艾滋病患者PM临床优势株酵母相全 长cDNA文库，并在此基础上对其功能基因组开展 全面的研究【7|。本文经Blas仅从文库中识别出PM 溶血磷脂酶基因的全长编码基因，对其进行生物信 息学分析，预测其理化性质、结构和功能特征，分析 其种系进化规律，为进一步克隆表达基因，探讨溶血 磷脂酶在PM致病中的作用提供理论依据。 材料与方法 一、材料 艾滋病患者PM临床优势株酵母相全长cDNA 文库，由本课题组构建。文库载体为pDONR222 (MtID静l公司)，文库的大规模测序由上海In访t嘴n 公司完成，Unigene通过Washingt(m大学的Wu—bl鹤t 程序(版本2．0)进行识别。编码溶血磷脂酶的文库 质粒编号为fy79．1368。 二、方法 1．文库的筛选及目的基因的获取 用Wu．bl鹊仅方法对57端测序结果进行同源性 分析。对于同源性分析结果，依据200cp、95％的标 准进行Uni靴归并；对3’端测序结果，也依据以上 进行归并。使用P蝴砸D(版本0．99cr722c)和 P|乳心(版本O．990329)程序对有3’端测序结果的 克隆进行序列拼接。拼接后的序列利用NcBI站点 的BLASrI’x、BI．ASnl、BLAS珏'p(http：／／www．ncbi．nh茂． nill．伊v／BLAsr)分别在核苷酸及蛋白水平上与Gen． BarIl【中的序列进行在线对比分析，同时判断该基因 是否系全长基因，目的基因序列测序是否正确。 2．基因的识别与功能预测 用Vec研Nrll觚te8．0中的开放读码框(ORF) Finder确定其完整的编码序列(cds)，用Tms“帆程 序推导并输出氨基酸序列。在NCBI站点上寻找 ORF，通过‰torNⅡ8．0软件包和蛋白分析专家系 统Exp鹪y所提供的蛋白组学和序列分析工具对推导 的蛋白进行结构与功能预测。(1)n砒缸珊：预测蛋 白的理化性质，如相对分子质量、等电点、氨基酸组 成、摩尔消光系数、重组产物在细菌、酵母和哺 乳动物细胞中的半衰期及在溶液中的稳定性等。 (2)Moti氐arI：预测蛋白一级结构中的糖基化、脂酰 化、磷酸化、硫酸化、糖基化磷脂酰肌醇(GPI)锚着位 点等修饰位点和模序。(3)Ta孵tP：分析亚细胞定位 序列等特征序列，包括：预测蛋白质是否具有信号肽 (Si朗alP)。(4)Inte肌sc锄：扫描蛋白一级结构中包 含的结构和功能域特征序列。(5)PredictProlein：预 测氨基酸序列的跨膜区和拓扑结构以及二级结构、 分子的亲水性、溶液中的分子形态等。(6)S丽ss．咖deI： 通过二级结构比对和折叠，模拟或模建蛋白的三维 空间构象。 3．分子进化树的构建 将分析所得的同源氨基酸序列进行编排，利用 VectorNH鲫ite8．0软件包中的mi碳，对PM溶血 磷脂酶与GenBank中其他物种的同源蛋白序列进行 比对分析，构建分子进化树。 结 果 一、基因识别和序列分析 根据获得的uIIigene序列，用BIASlln和BI。Asrrx 进行比对分析，判断是否为未知基因，从而筛选出 PM未知基因P79．1368。将该基因的氨基酸序列输 入NcBI数据库进行同源性比较，发现其GenBaIll【中 的球孢子菌的溶血磷脂酶具有较高的同源性，由此 判断该基因是溶血磷脂酶的同源基因。该基因全长 1014bp，在5’端和3’端都有非区，可能包含PM 溶血磷脂酶的全长基因序列。ORFFinder分析发现 其含6个可能的ORF，其中最长的ORF从第78到 第809bp，起始密码子为ATG，终止密码子为TGA， 完整ORF含729bp，编码243个氨基酸。 国匪煎筮痘堂笾鎏瘟堂盘查垫!!生璺旦筮塑鲞筮2塑丝』墅蜊l麴堕：趔!垫!!：盥：塾：№：2 表l PM溶血磷脂酶与其他生物来源溶血磷脂酶的 氨基酸序列同源性比较 项目嚣警萎誓葶裂猕猴牛人家蚕誓小鼠 分值306223175175176172170170l国l胡167 一致性(％)6446 4l 42 40 40 4040勰4l40 相似性(％)746l 59 56鳃58’5858 59 58 57 注：PM为马尔尼菲青霉菌 二、蛋白结构和功能预测 1．蛋白的物理化学性质预测 对P79．1368编码的溶血磷脂酶的物理化学性质 预测显示：其理论相对分子质量为26800，预测等电 点(pI)为5．49，疏水氨基酸占47．7％，亲水氨基酸占 26．8％，酸性氨基酸占12．7％，碱性氨基酸占 12．8％。分子式为C1214HI铂IN3130blSlo。280脚处的 摩尔消光系数为28伽L·啪lo·cfIl～，0．1％浓度 (1g／L)的‰为1．06l。当蛋白序列的N端为蛋氨 酸时，该酶在哺乳动物网状红细胞体外表达的半衰 期为30h，在酵母体内表达的半衰期大于20h，在大 肠埃希菌体内表达的半衰期大于10h，在溶液中的 不稳定指数为47．24，高于阈值(40)，在溶液中性质 不稳定。疏水指数为78．72，总亲水性一0．294，蛋白 总体疏水性较高。 2．蛋白功能位点的预测 Motifsc肌分析显示：PM溶血磷脂酶含有2个潜 在的酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点：43～46雒、 236—239姐；3个潜在的蛋白激酶C磷酸化位点： 2—4勰、194～196龃、209。21l龅；7个潜在的N．肉 豆蔻酰位点：24—29硇、34—39祖、94—99强、113一 118龃、127．132勰、143。148锄、212～217髓；2个 潜在的环腺苷酸磷酸化位点：13一16雒、40～43龃； 1个潜在的G倪I位点：216～243匏；一个酯酶位 点(Este溉)：17—140锄；1个自水解酶位点 (m)hydmlase)：5—233融。 3．亚细胞定位 ． 该蛋白可能含有细胞外锚定序列，但不含分泓 信号肽。 4．蛋白一级结构中包含的结构和功能域特征 序列 功能域特征分析显示，该氨基酸序列属于溶血 磷脂酶样功能域特征蛋白酶，其中l一236龃含邢 水解酶的功能域(AbhyolIolase)，6—23l舳含有磷脂 酶或(羧酸)酯酶的功能域，46—235艇含溶血磷脂 酶I的功能域(Lys叩h嗍)h‘)lipaseI)，见图l。 5．蛋白的二级结构及拓扑结构 PredicⅡ，ro【ein预测其a螺旋、B折叠和无卷 曲的比例分别是：27．98％、16．46％、55．56％，该蛋白 的二级结构以无规卷曲为主。预测蛋白的溶剂可及 性，氨基酸残基表面暴露超过16％的定义为暴露氨 基酸(e)，其余的称作包埋氨基酸(b)；从分析结果 看，该蛋白中53．09％的氨基酸残基暴露在溶液界 面，46．9l％的氨基酸残基包埋在蛋白内部，e和b的 比例大致相当，见图2。 MSYRAPFWP^I珏HT^WT姒HcLGnSG^G吖GL^0肼躲RS髓髓VSFIFPN^糟IPI 髓 EEEEEEHHH删删H删H舢髓E髓 eee eeeeebbbbbbbbbeb ebbebe ebeebbbbbbbe Tv删硼TMPG盯DI_^lILGQ蹦DFEE^口账QDEP6ILKSRDyINGLI旺E工DK6I^PSRII EEEE删H删唧唧删删H删删E比 bbbbbbbb b eeee eeeeeeebeebebbbbeebeeebeebb IcGFSOGGAISLFTGlTSP眦LGGlFGLSSYLLLATKLKEFSPPGGELP～^l【TPFFLAHG ． 既E H删删删}嗍 EEEEE髓 EEE髓 bbbbbbbbbbbbbbbbPPbbbbbbbbP e eePPbbbbbbbb YEDPWKYEFcDMTQlcIILK删6FDVEF}ISY嘣．删S^DP髓IQDLED．nIEKILpptSGEEA乱 H唧删H咖唧 EEE髓删删H咖HHH唧 eebeebbebbebbeeebebbbbbeebebeb ebbeebeeeeeeeeee 注：e：暴鼹氨摹酸；b：包埋氨基酸 圈2马尔尼菲青霉菌溶血磷脂酶的二级结构和溶剂可及性(亲水性) 圈l 马尔尼菲青霉菌溶血磷脂酶一级结构中的功能域 垦隧远复瘟堂僮垫瘟堂盘查垫!!堡!旦筮望鲞箜2塑陋』旦迪型!避堕：皇趔垫!!：!堕：垫：坠：2 6．蛋白的三维结构图 S丽睁咖del将PM溶血磷脂酶与蛋白结构数据 库中的蛋白质三维结构进行匹配，输回模拟的三维 结构图(1．235勰)，见图3。 圈3马尔尼菲青霉菌溶血磷脂酶(1—235勰)三维结构 三、分子进化树的构建 对PM与其他11个物种溶血磷脂酶的氨基酸序 列进行分子进化树的构建，包括真菌球孢子菌(C． 肿涨k托)、稻瘟菌(肘．卯砒)，多细胞低等生物日本 血吸虫(S．脚溅)、罗阿丝虫(锄加)，无脊椎动 物桑蚕(曰．瑚玎)、刺舌蝇(G．脚措施瑚)，低等脊椎 动物非洲蟾蜍(‰唧嬲)，哺乳类动物小家鼠(肘． ml硼以吣)、牛(口．钯删)、猕猴(JjIf．m比抛)及人类 (日．s印溉)，结果显示，PM溶血磷脂酶与球孢子菌 溶血磷脂酶在进化上属同一分支，与非洲蟾蜍、牛、 猕猴的进化关系最远，见图4。 蚕(O．2752) 期舌蝇(0．32儿) 球孢子蕾(O．2231) ’P79一1368(O．2338) 瞌菌(O．4073) 日奉血吸虫(0．6354) L——————一罗阿丝虫(O．4194) r^类(0．0044) o小家鼠(0．O¨3) · ’牛(0．0316) -猕猴(O．0368) 。非洲■埝(0．1076) 注：PM：马尔尼菲青霉菌；P79．13醴：PM的未知基因 圈4 PM溶血磷脂酶与其他物种溶血磷脂酶的分子进化树 讨 论 溶血磷脂酶是多种致病性真菌，例如白色念珠 菌、烟曲霉和新型隐球菌重要的毒力因子㈨o|，越来 越引起人们的关注。PM是一种温度双相性机会性 致病真菌，对艾滋病患者具有很强的侵袭力。由于 目前PM的全基因组序列仍不清楚，对PM潜在致病 因子的溶血磷脂酶了解甚少，我们从2009年开始启 动系统的艾滋病患者PM优势株功能基因组学研 究，建立了PM临床优势株酵母相全长cDNA质粒文 库【7|，着力于研究溶血磷脂酶等毒力因子在PM致 病机制中的作用。 生物信息学是一门研究生物信息的交叉学科， 综合了计算机科学、信息技术、数学、物理及化学等 领域的理论和方法，是研究生命起源、进化、遗传和 发育最有效的方法之一【11]。’其主要内容包括核苷 酸和氨基酸序列分析，新基因的发现和蛋白结构的 预测等。本研究利用一些操作简便、功能强大、分析 比较准确的分析软件和程序包，对聊溶血磷脂酶 基因及其编码蛋白的结构和功能进行了较为全面的 生物信息学分析，初步理论预测其结构特征、理化性 质及功能，并从氨基酸序列的差异分析生命演化过 程中基因的变异及进化规律，为进一步的功能研究 寻找线索。 我们从构建的PM酵母相全长cDNA质粒文库 中识别出溶血磷脂酶样的全长基因序列，其编码的 氨基酸序列与球孢子菌的溶血磷脂酶氨基酸序列一 致性最高，达“％，相似性达74％，是溶血磷脂酶的 同源基因。蛋白理化性质推测该基因编码的蛋白理 论相对分子质量约26800，pI为5．49，以疏水氨基 酸为主(47．7％)，总体疏水性较高(疏水指数 78．72)，在溶液中性质不稳定(不稳定指数47．24)。 因此，当克隆表达和纯化此蛋白时，需要考虑其理化 特性，采取相应对策增加表达纯化蛋白的稳定性。 蛋白功能位点分析显示，该基因编码的蛋白含有潜 在的酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点和蛋白激酶C磷酸化 位点，说明该蛋白属于溶血磷脂酶家族。基于溶血 磷脂酶在真菌侵袭人体中的重要作用，此蛋白酶可 能成为潜在的药物作用靶标。功能域特征分析显 示，该基因编码的蛋白包括磷脂酶或(羧酸)酯酶的 功能域和溶血磷脂酶I的功能域，再次证实该蛋白 是具有溶血磷脂酶样功能域特征的蛋白酶，而且说 明溶血磷脂酶相关位点及催化位点高度保守，适合 用于研究物种进化。从蛋白的二级和三级结构图 看，PM溶血磷脂酶形成p转角和口螺旋的氨基酸序 列比较保守，使得各物种溶血磷脂酶的各个肽段形 垦匿速堑盈堂篮鎏盈堂塑查垫!!生!旦筮塑鲞蔓!塑!熊』巫蜊!堡型堕：纽鲤垫!!：!生：塑：№：2 成比较一致的折叠。这是各物种的溶血磷脂酶空间 构象相似的基础。 构建的分子进化树显示，所有物种的溶血磷脂 酶起源于同一个始祖分子，PM溶血磷脂酶与球孢子 菌溶血磷脂酶的亲源关系最近，与非洲蟾蜍、牛、猕 猴溶血磷脂酶的进化关系最远。该分子进化树基本 符合脊椎动物的种系进化次序，但蛋白在进化上与 哺乳类动物比与低等脊椎动物(非洲蟾蜍)更接近， 这可能与PM感染寄生于哺乳类动物，尤其人类和 小鼠相关。溶血磷脂酶分成I型和Ⅱ型，至于我们 得到的PM溶血磷脂酶属于I型还是Ⅱ型，有待进 一步酶活性鉴定。 综上所述，利用生物信息学方法对PM溶血磷 脂酶基因的结构和功能进行预测，为进一步对该基 因进行克隆、表达及可溶性重组蛋白的纯化，研究该 蛋白的功能及其在PM致病中的作用提供了可靠的 理论依据。 参考文献 [1] 李凌华，唐小平，蔡n平．101例艾滋病合并马尔尼菲青霉病 的临床研究．中国艾滋病性病杂志，2008，14(1)：12．14． [2] Wu1℃，Qm删，№cK，daI．a“ealp豫H删脚andout一 ·77· cofn睁0f酬阮肌舢坍l椭inf＆ti∞8：a8甜髓触n1994t02∞4． Ho|lg勋ngMedJ，2008。14(2)：103．109． B啪dk甜V。l(1lm盯s，鼬【ll【j帅isD．凡耐础矗肌删—碜i：the p棚hogeIlm锄rdoo喊ep．IIldi矾JDe酬V朋e删驯．2009，75 (6)：619舵0． Kark盯wsI‘a．KuktaJ。RapaIa-K眩ikM，K睨波A．nlllgi弘Il}l唧icto llIln脚s：哪甜郫ul盯b船幅0fvimIerIce0fC翩拙扔缸咖l。Ci印幻- 删舶而帆傩and一驴帕触吨呻‘譬．胁aBi幽P01．2009， 56(2)：2ll一224． MaL，)(ieL．D嘶gx。eta1．Role0f既雠旧，uul封phl0叩hoKp明eB0f o帆d池—6泐瑚幽aviml明tfhd盯in刚m酬k日吐册可c0出． CIlrrEyeR∞，2009，34(9)：76l·768． S甜嵫A，Es【硼蝓P，cast哦池E．blvitIodel哪lliIIa土i傩0fviⅢ． 1encefhcto糟acti“tya鲫DciatedwitIl鸵vefaJo卯幻∞衄拈删吲抽，哪 clillicali“籼．RwII)ero∞Micol，2008，25(3)：145．149． 李凌华，胡凤玉．陈万山，等．艾滋病患者马尔尼菲青霉菌 优势株酵母相伞长cDNA文库的构建和初步分析．国际流行 病学传染病学杂志，2010。”(5)：291．295． MuklIelj∞PK，瞄鲫KR，_出cIISD．etaI．R洳瞰Iuctim0ftIle 肿l静埒in幻Qn出出口f6幻硼s帐^or荡vimI珂weiII“vo．^lic肛 biolo盯，2001．147(9)：2585．2聊． R舸仳ntefiaA，L6p胁M0li矾N，I|ldwigA。etaI．(；ef·∞mld m矗钾Ill荡invdvediIIA驴机g舭^朋龟n如“mler脱．R柙m即姗 №c01．2005，22(1)：1．23． 鲥幽sAR。洲I代，删ghtLc．etaI．CeⅡ砌l—lim涮嗍灿 coccaipllospholipa鸵BIisa印urce0fsec陀ted肌zymemldadet枷- Ⅻt0fcell讪iI蜊ty．J酬a踯。砌。勰2(52)：7滩 7514． 黄科，曹家树．生物信息学．情报学报，20吆，2l(4)：491-496． (收稿日期：20ll舵．13) 欢迎参加全国医学论文写作研修班 为提高广大作者的医学论文特别是英文医学论文的写作水平。中华医学会中华医学杂志英文版定于2011年6月在广州、7 月在银川分别举办两期“全国医学论文写作研修班”。研修班邀请国内有丰富审稿、投稿和英文写作经验的专家进行授课： 如何撰写易被杂志接受的中(英)文医学论文；如何报告临床随机对照试验；论文写作中的伦理学问题；医学研究和论文写 作中的统计学问题；向国内外英文医学期刊投稿的注意事项；国际一流医学期刊的稿件处理程序；临床试验注册；临床工作中 的科研选题；中华医学杂志英文版网上稿件处理系统简介。 培训班授予国家级继续教育I类学分8分。有意参加此研修班的同志，请与中华医学杂志英文版编辑部孙静编辑联系。 地址：北京市东城区东四西大街42号，邮编100r710；电话：01m85158320；传真：01阻85158333；Bnlail：剐mj@c眦．ofg．∞。详情请及 时浏览中华医学杂志英文版网站www．cmj．org。 中华医学杂志英文版编辑部 2011年3月 引 铂 卯 甜 加 町 明 m 儿 rL rL rL rL rL r【rL rL rL