0Toll样受体4表达及与多脏器功能损伤的关系

和途径还不甚明了，但比较一致的意见是组织损伤、感染、缺血 等因素导致胃肠道粘膜屏障功能受损、免疫抑制和肠道菌群改变，三者相互作用可促使肠 源性内毒素通过血液、淋巴、腹膜等途径移位至远隔器官。肠源性因素在ANP继发感染 中的作用和重要性已被认识并确立。在ANP早期，肠道是全身炎症反应的一个靶器官，而 发生的肠道屏障损害则成为肠道细菌移位的一个重要原因。移位的肠道细菌和毒素使循 环中的细胞因子再次升高，对全身各脏器造成再次损害，形成所谓的“二次打击”。研究表 明，肠源性内毒素血症不仅与AP的严重程度密切相关，而且是导致SAP并发多器官功能 衰竭的主要原因【_”。事实上，无论是早期的血管、毒素反应，还是后期的脓毒症，内毒 素(1ipopolysaccharide，LPS)都是SAP疾病进程的重要促进因素。 LPS是G。细菌细胞壁的主要成分，也是其主要的致病因素，可被先天性免疫系统的模 式识别受体所识别。对内毒素信号传导通路的研究是近20年关注的热点，目前发现的诸 多内毒素受体或信号转导分子中，Toll样受体(Tolllikereceptors，TLRs)的发现被认为是这 一领域划时代的发现。Toll蛋白是一种古老的蛋白，最早是在研究果蝇细胞胚胎发育中 发现的，可介导对多种细菌和真菌感染的天然免疫。1997年Medzhitov等首次发现人类 1 兰刿盔鲎堡=!三堂焦堡蔓 Toll蛋白吼次年P01torak等发现了T0n样受体4(Toll—LikeReceptor4，TLR4)并阐明了其 基因结构和生物学作用19】。TLRs是模式识别受体的-S0，参与天然免疫及获得性免疫， 是机体抗感染免疫及炎症反应的主要识别受体，是目前发现的唯一将细胞外抗原识别信 息向细胞内传递并引发针对该抗原一系列免疫反应的关键跨膜蛋白，它亦可通过识别机 体内源性物质及信号传导引发免疫反应或对该反应进行调控。经该受体抗原识别后产生 的信号传导，直接影响机体的免疫反应强度和性质。 有关TLR4激活机制及在内毒素信号传导通路中作用的研究多集中于脓毒血症，且 多为体外实验。实际上任何一种症状或疾病的发生都不是孤立的，往往有其特定的发病 背景或发病基础。脓毒症在l临床上大多以某种疾病的严重并发症形式出现，如创伤、休 克、严重感染等，把TLR4放在具体的疾病中研究可能更有临床指导意义。有关TLR4在 AP中作用的研究报道不多，体外研究已经证实TLR4对AP的发生发展有重要的介导作 用。我们选择合适的动物模型模拟人继发性坏死胰腺感染，观察感染期大鼠肺、肝、肾、 肠等脏器功能的损伤情况$[ITLR4在肝、肠的表达变化，初步探讨内毒素信号传导通路， 尤其是TLR4对SNP发生发展的介导作用。 2 兰州大学硕士学位论文 第一部分大鼠重症急性胰腺炎感染期模型的建立 及与多脏器功能损伤的关系 材料与方法 一实验材料 (一)实验动物 成年雄性Wistar大鼠100只，体重200—250克，清洁级(兰州大学医学动物实验中 心提供)。随机分组后置兰州大学第一医院外科动物实验室适应性饲养2周，12小时昼 夜交替，控制室温15—25。C，相对湿度40％一50％，保持环境清洁。专用饲料喂养，自 由摄食及进水，饲料及饮用水新鲜无污染。于实验前12小时禁食，可饮水。 (二)实验试剂 (1)碘伏消毒液(上海试剂一厂) (2)l％戊巴比妥钠(兰州大学药学院药理教研室提供) (3)牛磺胆酸钠(Sigma公司) (4)LPS(Sigma公司) (5)多聚甲醛(上海试剂一厂) (6)PBS液(自配) (7)多聚赖氨酸(博士德生物工程公司) (8)无水酒精(西安化学试剂厂) (9)二甲苯(西安化学试剂厂) (10)蒸馏水(兰州大学第一医院制剂室) (11)MPO试剂盒(南京建成生物制品研究所) (12)SIgA放免试剂盒(上海放射免疫分析技术有限公司) (三)实验仪器与设备 (1)动物手术台(兰大一院外科实验室提供) (2)电子天平(上海天平仪器厂) (3)手术器械(兰大一院外科实验室提供) (4)高压消毒锅(上海三申公司) (5)SANY0MDF—U71V一80℃冰箱(三洋公司) 兰州大学硕士学位论文 (6)荣事达BCD一241—24℃冰箱(荣事达公司) (7)OLYMPUS光学显微镜(日本Olympus公司) (8)电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司) (9)DK600型恒温水箱(上海精宏实验设备有限公司) (10)载玻片、盖玻片、记号笔 (11)容量瓶、烧杯、试管、移液枪(兰大一院外科实验室提供) (12)切片机、烘片机、展片机(德国Leica) (13)全自动r免疫计数仪(西安二六二厂，型号FJ一2008) (四)相关溶液的配制 (1)0．1MPBS液NaCL8．Og，KCLO．209，NazHP04·H201．569，NaH2P040．209，加蒸 馏水至1000ml，封装4℃保存。 (2)4％多聚甲醛多聚甲醛409溶于500mlO．1MPH7．4PB$液，加热至60。C，滴加 lmol／L的NaOH至溶液清亮，冷却后补充O．1MPH7．4PBS液至1000ml，过滤，4。C保存。 (3)1．10多聚赖氨酸溶液将lml多聚赖氨酸加入9ml蒸馏水，充分搅拌，过滤， 4℃保存。 二实验方法 (一)动物分组及模型制作 (1)1％戊巴比妥钠(4ml／kg)腹腔内注射麻醉。 (2)麻醉平稳后，将大鼠仰卧固定于手术台上，常规腹部碘伏消毒，铺消毒巾。 (3)取正中切口进入腹腔，提起十二指肠，在胆胰管开口略偏下系膜缘对侧肠壁上选 一无血管区，用4．5号钝头穿刺针扎穿肠壁，自乳头开口穿入胆胰管约5mm，用动脉夹夹 住胆管入肝处，缓慢、恒速注射3．5％牛磺胆酸钠(NaTc)0．1mg／kg，1分钟注射完，压 迫十二指肠穿刺部位5分钟，脏器复位后关腹。 (4)第一组(n-24)：sham组，仅行胆胰管插管，不注射药物，再随机分3组，每组8 只。 (5)第二组(n=37)：NaTc组，胆胰管逆行注射3．5％牛磺胆酸钠，再随机分4组， 其中一组(n=13)观察24小时动物存活率。 (6)第三组(n-39)：NaTc-fLPS组，胆胰管逆行注射3．5％牛磺胆酸钠后2小时腹腔 注射LPS5mg／kg，再随机分4组，其中一组(n=15)观察24小时动物存活率。 (二)观察指标及方法： (1)各组动物在手术后的进食及活动情况。动物16及24小时死亡率。 4 兰州大学硕士学位论文 (2)开腹前腹腔注射生理盐水5ml，开腹后观察腹水、腹腔情况及胰腺大体病理变化， 收集腹水测淀粉酶。 (3)分别于术后4、8、16小时各时相点处死动物，打开胸腔自右心房抽静脉血，置 于无菌普通试管中，经2000rpm离心lOmin，分离血浆和血清，4。C冰箱存放，以全自 动生化分析仪检测血清淀粉酶、GOT、GPT及BUN。 (4)于主动脉弓切开插管结扎固定，右心耳剪开为灌洗液流出口。生理盐水灌洗至 肝脏变白，回流液清亮后以4％多聚甲醛灌注，至肝脏变白、组织变硬后，切取胰腺，修 剪去脂肪，切取部分称重，放入烘箱内90。C烘烤48小时后取出，立即称重、记录，计算 湿／干比。肺组织也用同样方法取材并计算湿／干比。 (5)切取部分肺脏、肝脏、胰腺、肾脏、小肠，4％多聚甲醛固定，石蜡切片、HE 染色，光镜下观察病理变化。病理观察由两位事先不知分组情况的专一病理医师完成。 胰腺组织病理评分按Schmidt法Ⅱ0】进行。肠粘膜损害参照Chiu分级【11】，O—V级分 别计0．5分进行病理评分。评分标准如下： 急性坏死型胰腺炎病理学评分标准 水肿 积分 无0 局灶性叶内间隔扩张 0．5 弥漫性叶内间隔扩张 1 弥漫性叶内间隔扩张+局灶性小叶内间隔扩张 1．5 弥漫性叶内、小叶内间隔增宽 2 弥漫性叶内、小叶内间隔增宽十局限性腺泡间隔增宽 2．5 弥漫性叶内、小叶内、腺泡间隔增宽 3 弥漫性叶内、小叶内、腺泡问隔扩张+局限性细胞问间隔增宽 3．5 弥漫性叶内、小叶内、腺泡间、细胞间间隔增宽4 出血和脂肪坏死 积分 无 1个区域0．5 2个区域 1 3个区域 1．5 4个区域 2 5个区域 2．5 6个区域 3 7个区域 3．5 8个区域 4 腺泡坏死 无0 1-4个坏死细胞／高信视野，单处0．5 1—4个坏死细胞／高倍视野，多处 1 14个坏死细胞／高倍视野，多处+5，10个坏死细胞／高倍视野，单处1．5 兰州大学硕士学位论文 5一lO个坏死细胞／高倍视野，多处 5．10个坏死细胞／高倍视野，多处+11．16个坏死细胞／高倍视野 11—16个坏死细胞／高倍视野，多处 11—16个坏死细胞／高倍视野，多处+>16个坏死细胞／高倍视野， >16个坏死细胞／高倍视野，多处 自细胞浸润程度 小叶内或血管周围0—1个白细胞／高倍视野 小叶内或血管周围2．5个白细胞／高倍视野 小叶内或血管周围6．10个白细胞／高倍视野 小叶内或血管周围11-15个白细胞／高倍视野 小叶内或血管周围16．20个白细胞／高倍视野 小叶内或血管周围21．25个白细胞，高倍视野，或局灶性微脓肿 小叶内或血管周围26—30个白细胞／高倍视野，或局灶性微脓肿 小叶内或血管周围>30个白细胞／高倍视野 小叶内或血管周围>35个白细胞／高倍视野 单处。2．5 单处 3．5 4 O 0．5 1 1．5 2 2．5 3 3．5 4 肠粘膜损伤分级标准 0级：正常肠粘膜； I级：肠粘膜绒毛顶端出现上皮下间隙，同时伴有毛细血管充血： II级：肠粘膜绒毛顶端出现的上皮下间隙扩大，部分上皮与固有层分离； IⅡ级：大部分粘膜绒毛上皮与固有层分离，部分绒毛顶端上皮剥脱； Ⅳ级：剥脱的绒毛伴有固有层和扩张毛细血管暴露，固有层可见有炎性细胞浸润； V级：固有层脱落、出血和溃疡形成。 (6)固定部位切取部分肺脏、肝脏、胰腺、小肠组织(距回盲部5cm)即刻液氮保 存备检。回盲部取肠内容物卜29，～20。C冰箱存放各检。 (7)胰腺组织MPO活性测定：取液氮冷冻胰腺组织0．59研钵研碎置入试管进行匀 浆，用考马斯亮兰法测定蛋白质浓度，MPO活性测定按下述操作步骤进行 试剂空白 对照管 测定管 蒸馏水(m1) 0．2 3 样本(m1) 0．2 02 试剂四(m1) O．2 0．2 02 显色剂(m1) 3 3 泄匀，37℃水浴30分钟 试剂七(m1) O．05 0．05 O．05 混匀，60℃水浴10分钟，在460nm处测定各管OD值。 (8)放射免疫检测肠内容物SIgA水平变化 1)标本处理：肠内容物反复冻融后生理盐水原倍稀释，经2000rpm离心10min，提 6 兰州大学硕士学位论文 取上清夜。取上清夜0．5ml，按下述操作进行。 2)操作方法： 试管编号 1—2 3．4 5．6 7—8 9一10 1l一1213．1415．1617—1819—20 试剂(m1)T NSB标准液浓度(ug／m1) 测定管 0 0．31 0．6251．25 2．5 5 10 标准液 0．1 O．1 O．1 O．1 01 Ol 0．1 0标准液 02 待测标本 0．1 1“I—Ag 0．1 01 01 0．1 0．1 O．1 O．1 01 O．1 01 Ab 0．1 0．1 0．1 0．1 01 01 01 O．1 混匀，置37℃水浴60分钟 第二抗体 0．05 0．050．05 O．05 0．05 O05 0．嘶 0．05 0．05 混匀，置37"(2水浴30分钟，取出置4"C10分钟 6％PEG试剂 O．5 O．5 0．5 05 05 0．5 05 0．5 0．5 充分混匀后测各管总放射性(T)，以3000rpm离心15分钟，弃去上清，测各管沉淀 放射性(Bn)。 3)计算：N／T(％)=NSB／Txl00 结合率(％)=(Bn-NSB)／(Bo-NSB)x100 以各标准管测得的结合率的Logit值为纵坐标，各标准管的不同Ag浓度的Log值为 横坐标，绘制标准竞争抑制曲线。样品结合率在标准曲线查得每mlAg含量，乘上稀释 倍数即为其实际含量。 (三)统计方法：所有数据均以均数±标准差(j±s)表示。应用SPSSIO．0统计软 件进行统计学处理，根据数据不同采用方差分析、t检验或非参数检验，P(0．05时检 验有统计学意义。 结果 一活体动物观察 sham组动物术后活动正常，进食及饮水无影响；NaTc细动物精神萎靡不振，活动明 显减少，不进食及饮水，竖毛，毛发无光泽，腹部明显胀大；NaTc+LPS组动物表现较 NaTc组动物更严重，晚期几乎呈濒死状态。 7 兰州大学硕上学位论文 二死亡率观察 ． NaTc组动物术后16、24小时死亡率分别为30．8％(4／13)和53．9％(7／13)，NaTc+LPS 组动物术后16、24小时死亡率分别为47．1％(8／17)和94．1％(16／17)。NaTc+LPS组 动物死亡率较NaTc组显著增高(P<0．01)。 三血清、腹水淀粉酶变化(表1，表2，图1，图2) 模型组各时相点血清淀粉酶均高于假手术组(P<0．01)，且组内各时相点淀粉酶变化 逐渐升高，NaTc+LPS组各时相点血清淀粉酶高于NaTc组(P0．05)；假手术组腹水很少，模型组血性腹水量3-12ml，淀 粉酶测定随时问延长而升高，与sham组相比差别有统计学意义(P<0．01)，术后16hNaTc 组与NaTc+LPS组腹水淀粉酶差别无显著性(P>O．05)。 表1大鼠血清淀粉酶变化(IU／L，j±s) 注：组内与4h比较*P<0．05；组间比较6P<0．01。 14000 12000 毫10000 曷8000 疽6000 聃4000 2000 O 4h 8h 16h 图1血清淀粉酶变化 表2大鼠腹水淀粉酶变化(IU／L，Xis) 注：组内比较*P<0．01，**P<0．05；模型组与sham组比较P<0．01；模型组组问比 较6P<001，“P<0．05。 14000 12000 ≤10000 —8000 疽6000 ：卧4000 2000 0 4h 8h 16h 图2腹水淀粉酶变化 三胰腺、肺脏组织湿／干比值(表3，表4，图3，图4) (--)胰腺组织湿，干比值 模型组组间差异有显著性(P<0．05)，同时相点NaTc+LPS组与NaTc组相比差异有显 著性(PO．05)。 20 一15 掣 己10 2 =5 0 4h 8h 16h 图8胰腺组织MPO水平变化 5 =4 日 葛3 j =2 b0 爿1 0 4h 8h 16h 图9肠内容物SIgA含量变化 注：图8、图9为大鼠胰腺组织MPO活性及肠内容物SIgA含量变化趋势图。Sham 组(+)，NaTc组(·)、NaTc+LPS组(：)。1 七肠内容物SIgA含量变化(表6，图9) 制模后肠内容物SIgA的含量逐渐减少(P<0．01)，至16h达到最低：NaTc+LPS组 SIgA含量较NaTc组降低更明显(PO．05)。 (表6)大鼠肠内容物SIgA含量变化(ug／L，jis) 注：组内比较+P<0．01，“P<0．05：模型组与sham组比较P<0．01；模型组组间比较△ P<0．01，△△P<0．05。 讨论 目前胰腺炎的发病机制及病因、病理生理尚未完全阐明，治疗仍是世界性的难题。选 择～个理想的动物模型是进行胰腺炎研究的基本条件之一，这种动物模型必须是既适合 实验

设计

领导形象设计圆作业设计ao工艺污水处理厂设计附属工程施工组织设计清扫机器人结构设计

目的，又重复性好，简单易行，更重要的是其形态学改变、自然发展过程近似人 12 兰型查兰塑圭兰垡堡塞 类胰腺炎病变且具有同样的治疗反应等特点。迄今为止，尽管还没有一种动物模型能完全 模仿人类胰腺炎的病因及疾病过程，但是根据实验设计及其他具体情况选择现有的相应 模型，重现胰腺炎某些阶段的形态及病理生理改变，对阐明胰腺炎的发生及发展仍具有重 要意义。在众多的活体动物模型中，胰胆管逆行注射法是最古老也是应用最广泛的急性出 血坏死性胰腺炎动物模型的制作方法，吐tAho等Il2J于1980年首先报道，后虽经改良，但主 要原理未变。该模型的原理是根据返流学说，向动物胰管内逆行注射某些物质，直接损害 胰腺组织或通过激活内源性胰酶损害胰腺而导致ANP，与人类急性胰腺炎的发病相似。 Aho等经十二指肠插管穿刺在大鼠胰胆管内逆行注入牛磺胆酸钠，在24h内引起胰腺腺 泡细胞水肿，出血，坏死等改变，成功率100％。国内有人【13]对不同剂量的牛磺胆酸钠诱导 AP模型进行了系列研究，分别用0．25％、1．O％、2．O％、3．5％牛磺胆酸钠溶液10u1／g体重逆 行注入大鼠胰胆管，发现1．O％和2．0％牛磺胆酸钠分别诱导轻度及重度AEP，3．5％牛磺胆酸 钠诱导ANP，发现胰腺病变程度与牛磺胆酸钠诱导浓度呈正相关。胰胆管内可注射的物质 还有胆汁+胰蛋白酶、弹力蛋白酶、磷脂酶A、细菌及毒素(如大肠杆菌、葡萄球菌的菌 体或毒素1、牛磺胆酸钠+肠激酶、牛磺胆酸钠+胰蛋白酶等，但应用较少。动物胰腺病变 程度与注射时胰管内压力、药液注射速度密切相关【14,15】。 目前文献中报道一般用5％牛磺胆酸钠诱导ANP。我们在1％、2．5％、3．5％、5％4 个不同浓度的牛磺胆酸钠进行反复实验，发现1％浓度仅能诱导AEP，2．5％浓度因注射 速度不同可诱导AEP或ANP，5％浓度诱导的动物模型死亡率高，12h可达50％，24h在 80％以上，3．5％浓度诱导的模型死亡率明显降低(24h在50％左右)，较稳定，最符合本实 验的要求。胰胆管逆行注射法诱导胰腺炎模型的效果肯定、迅速，致病因素与临床相似， 可以模仿胰管梗阻、胆汁返流，组织学变化和病程演变也与临床比较符合，而且随注射 速度、注射持续时间、注射压力、药物浓度不同可以产生轻重不同的胰腺炎，能较好地 控制胰腺病变严重程度，可用作观察AP中全身炎症反应、感染性胰腺坏死细胞内早期事 件变化，适合药物疗效的评价。 自19世纪以来，人们围绕急性胰腺炎的病因学、发病学及治疗学开展了大量的研究， 提出了一系列有关AP发病机制的学说。这些理论和假说虽未能完全阐明AP发病机制中 的许多环节，但为临床攻克这一顽症提供了新策略、新思路。Chiari于1886年提出AP是 ～种自身消化性疾病，是在病因作用下，胰酶在胰腺组织中异常活化而消化自身组织的结 果。目前认为导致胰酶异常活化的机制有：(1)十二指肠液返流到胰管，其中的肠激酶激活 胰蛋白酶原，加之十_指肠液可破坏胰导管上皮的防御屏障；(2)胆汁返流到胰管，其中的 13 兰州大学硕士学位论文 胆汁酸盐可激活胰蛋白酶原及磷脂酶A，并提高脂肪酶活性，同时可增加胰导管的通透 性；(3)胰酶过度分泌及异位分泌，这可见于I临床上高腊、高蛋白饮食或酒精摄入过量后引 起促分泌剂胆囊收缩素．促胰酶素分泌增加，或在实验中用其类似物如雨蛙肽注射，由此 引起胰酶过度分泌而诱发AP。此外，胰腺缺血、酸中毒等可引起腺泡溶酶体酶溢出，直接 和间接引起腺泡“消化”。尽管“胰酶自身消化学说”不能完全解释AP的发病机制，但 在阐述AP的发病中仍有一定的指导意义，而且随着研究的深入，不断有新的实验证据丰 富了该学说的内容。目前比较一致的观点是，在AP胰酶“自身消化”的损伤机制中，活化 的胰蛋白酶可能仅起“扳机”(trigger)样作用，由它进一步激活其他胰酶，如糜蛋白酶、弹 性蛋白酶、羧基肽酶、核酸酶、磷脂酶A2(PLA2)-等，进而引起和加重胰腺的损伤。1967 年，Anderson提出AP是一种以胰腺局部和全身血液变化为特征的疾病，血液循环障碍可 促使AEP向ANI'转化。随后，人们又发现氧化应激、NO及胰腺腺泡细胞钙超载在AP的 发病中起一定作用。上世纪90年代初，随着SIRS概念的提出，人们进一步认识到AP的 发生与单核巨噬细胞和中性粒细胞的过度激活导致大量细胞因子级联反应引起的SIRS 密切相关。 近年来，肠道细菌移位及继发性胰腺感染在AP中的作用受到高度重视。AP发生后 在胰腺周围发生的局部感染性并发症被称为继发性胰腺感染，主要包括感染性胰腺坏 死、胰周脓肿和假性胰腺囊肿伴感染等3种类型，常见于SAP发病2～3周后，是SAP患者 在病程中、后期死亡的主要原因，也是目前认为影响SAP死亡率及致残率最重要的风险 因素【5～1。多年来，临床上主要采用广谱抗生素和手术引流等方法进行对症治疗，效果并 不满意。 为进一步探讨感染在ANP时细胞激活以及胰外器官损伤进程中的地位与作用，我们 选择在诱导ANP开始后2hl；J动物腹腔内注射LPS进行“二次打击”，来模仿SAP患者发 生的感染性胰腺坏死。我们观察到在牛磺胆酸钠诱导的大鼠AP模型中，胰腺水肿、出血、 坏死，肺脏、肝脏、肾脏及肠道等远隔器官已经发生了损伤性变化，且随着病程进展损 伤在逐渐加重。当给大鼠腹腔内注射LPs后可明显加重胰腺炎相关的多脏器损伤及功能 衰竭，如观察到动物全身情况变得更差，几乎呈濒死状态，16d"时及24d"It,J-存活率较单 纯NaTc组明显降低；胰腺、肺湿／干比值增加，各脏器病理损害更趋严重；血清淀粉酶 及GPT、GOT、BUN等生化指标升高，血清TNF．Ⅱ水平也显著增高，反映肠道粘膜免疫 功能的肠内容物sIgA水平显著降低。这些结果既明存牛磺胆酸钠诱导的SAP大鼠腹腔中 注射LPS是模仿人SAP的一个较好的模型，模型中观察到的器官损伤也与临床上SAP病 f4 兰州大学硕士学位论文 人的病情发展相符合。因此用这个模型探讨sA_P的病因及发病机制是可行的。 目前已经证明，SAP时胰腺感染的主要来源是肠道细菌移位【16】。促发肠道细菌移位 的确切机制，目前尚不完全清楚。正常时一般有少量的细菌移位，并不产生肠源性感染，但 是当机体防御功能严重受损或有大量的细菌和内毒素侵入时，将会继发肠源性感染，甚至 导致MODSll7]。一般认为细菌移位的发生发展与肠道细菌过度繁殖、肠黏膜屏障损害 和机体免疫防御功能低下有关【17l。另外，SAP病程中产生的大量炎性介质如氧自由基、 血小板活化园子、TNF、白介素等对肠粘膜也有损伤作用，而且与内毒素～道，形成恶 性循环，推动力SIRS／MOD的发生发展。细菌移位的途径主要有经淋巴途径、经血液途 径和经腹膜途径。肠道不仅是重要的消化器官，而且还是人体最大的外周免疫器官。肠黏 膜免疫屏障作用是近年的研究热点。人体内分泌免疫球蛋白的细胞70％～90％分布在肠 道，并且全身约90％的循环免疫球蛋白直接作用于肠腔源性物质。分泌型免疫球蛋白A (sIgA)是体内分泌量最大的免疫球蛋白，主要由肠粘膜固有层浆细胞产生，是粘膜免疫屏 障的重要组成部分。可与相应病原微生物如细菌病毒等结合，阻抑其吸附到粘膜上；在穿 胞过程中对于己潜入细胞内的病毒具有中和作用；中和毒素如霍乱弧菌毒素、大肠杆菌 毒素等，并有维持肠道正常通透性和维持肠道微生态平衡等广泛的保护功能，成为机体 抵御肠道致病微生物的第1道防线。我们在实验中发现随着胰腺炎病程的发展，肠内容 物SJ融的水平降低，而且NaTc+LPS组各时相点的水平显著低于低于NaTc组(P<0．01)； 进一步发现随着肠内容物sIgA的水平降低，血清TNF-a水平显著升高，而且二者具有 相关性。说明SAP时机体肠道粘膜免疫屏障功能受损，LPS与肠道粘膜屏障功能损害有 关。研究表明内毒素可引起肠粘膜一系列病理改变：粘膜下水肿、肠绒毛项部细胞坏死、 肠通透性增加，从而破坏肠粘膜屏障功能””。由此可以看出，肠道不仅是MOD的靶器官， 也是MOD的启动者，保持肠道粘膜屏障的完整性对SAP的治疗有重要意义。 众所周知，中性粒细胞含有多种酶，如弹力蛋白酶、胶原酶、组织蛋白酶等，可以 水解血管和器官组织；中性粒细胞的过度激活和器官集聚是SIRS乃至MODS发生发展的 关键环节。MPO是中性粒细胞特有的酶，受刺激后释放，可用于反应中性粒细胞活化程 度。我们在实验中观察到NaTc组胰腺组织MPO水平显著升高，NaTc+LPSfH胰腺组织 MPO水平也呈升高趋势。文献报道119】?蓖；染性胰腺坏死动物肺组织MPO水平较单纯SNP 组显著升高。推测感染时中性粒细胞的释放和浸润对SAP时胰腺及远隔器官的损伤起促 进作用。国内有研究认为【201肠源性内毒素fffI．症可以促使AEP向JANP发展，而其可能的作用 机制是内毒素上调细胞粘附分子，促进中性粒细胞大量聚集，并释放许多细胞因子造成组 15 兰州大学硕士学位论文 织损伤。 AP特别是SAP，由于组织缺血、损伤、坏死及内毒素血症等原因造成循环中TNFat、 IL_113水平升高，进一步刺激IL-6、IL-8等的产生，细胞因子及炎症介质发生“瀑布反 应”，导致SIRS的发生，激活中性粒细胞，聚集于肺、肝脏等器官，但这时尚不致造成 严重的器官损伤，如果发生细菌移位、感染等并发症，则可刺激巨噬细胞活化，产生致 炎细胞因子，引起循环中第二次细胞因子高峰，过度激活中性粒细胞，对机体进行“二 次打击”，造成MOD，最后发展至MOF[2”。根据上述理论，可以看出细菌移位在SAP 发展至MOF的过程中起着至关重要的作用，如果能阻断这个关键点，攻克SAP治疗难关 将指日可待。近年来，人们针对SAP病程中肠道菌群移位和继发感染采取了许多治疗措 施。如预防性应用广谱抗生素，对感染采用手术引流，为预防细菌移位早期进行选择性 消化道清洁(SDD)、肠道营养支持和肠黏膜保护剂等，还有抗氧化剂、微生态制剂等来 治疗SAP的肠源性感染，疗效难尽人意。例如，预防性使用广谱抗生素可以控制全身感染 性败血症，SDD也可以在一定程度上减少肠道细菌数量和内毒素含量，但它们的共同缺点 在于造成了肠道耐药菌的过度滋生和优势定植，使病情更为复杂化。优势菌群移位至胰腺 周围坏死组织后，抗生素难以通过血胰屏障，使胰腺局部的抗生素浓度很低，治疗十分困 难。此外多次手术引流使患者遭受了巨大痛苦，住院时问延长，住院费用增加，生活质量明 显下降。 尽管随着对AP认识的不断深入和治疗水平的提高，SAP的死亡率及致残率有了大幅 度降低，但近年一直徘徊不前。目前认为感染性并发症是威胁SAP患者生命最重要的因 素【”。在实验研究中采取的许多被认为非常有效的针对坏死胰腺感染的措施，在临床上 并未取得如期效果，有些还存在争议。这一方面说明动物实验与临床有区别，另一方面 也说明AP在发病机制上还有许多地方未被认识。因此，深入研究感染在AP中的作用， 包括感染的原因，作用方式、途径及调节等，对进一步阐明AP的发病机制和指导SAP 的治疗有重要意义。结合目前人类对先天免疫研究的重大突破和分子生物学的研究进 展，为下一步SAP的基础和临床研究指出了方向，这也许是目前看来改善SAP预后的有 效途径。 兰州大学硕士学位论文 第二部分大鼠重症急性胰腺炎感染期肝脏组织及肠粘膜 Toll样受体4的表达及意义 材料与方法 一实验材料 (一)实验动物 成年雄性Wistar大鼠72只，体重200—250克，清洁级(兰州大学医学动物实验中 心提供)。随机分组后置兰州大学第一医院外科动物实验室适应性饲养2周，12小时昼 夜交替，控制室温15—25。C，相对湿度40％～50％，保持环境清洁。专用饲料喂养，自 由摄食及进水，饲料及饮用水新鲜无污染。于实验前12小时禁食，可饮水。 (二)实验试剂 (1)碘伏消毒液(上海试剂一厂) (2)3％戊巴比妥钠(兰州大学药学院药理教研室提供) (3)牛磺胆酸钠(Sigma公司) (4)LPS(Sigma公司) (5)多聚甲醛(上海试剂一厂) (6)PBS液(自配) (7)多聚赖氨酸(博士德生物工程公司) (8)无水酒精(西安化学试剂厂) (9)二甲苯(西安化学试剂厂) (10)蒸馏水(兰州大学第一医院制剂室) (11)2×SSC(自配) (12)生物素化鼠抗地高辛(博士德生物工程公司) (13)苏木素(自配) (14)DAB显色剂(博士德生物工程公司) (15)SABC(博士德生物工程公司) (16)30％过氧化氢(博士德生物工程公司) (17)胃蛋白酶(博士德生物工程公司) (18)封闭液(博士德生物工程公司) (19)生物素化过氧化物酶(I枣士德生物工程公司) 兰州大学硕士学位论文 (20)TLR4原位杂交试剂盒(博士德生物工程公司) (21)TLR4一抗(博士德生物工程公司) (22)TNFa放免试剂盒(解放军总医院科技开发中心放免所) (三)实验仪器与设备 (1)动物手术台(兰大一院外科实验室提供) (2)电子天平(上海天平仪器厂) (3)手术器械(兰大一院外科实验室提供) (4)高压消毒锅(上海三申公司) (5)SANYOMDF—u7lV一80℃冰箱(三洋公司) (6)荣事达BCD一241—24℃冰箱(荣事达公司) (7)OLYMPUS光学显微镜(日本Olympus公司) (8)电热恒温干燥箱(上海精宏实验设备有限公司) (9)DK一600型恒温水箱(上海精宏实验设备有限公司) (10)载玻片、盖玻片、记号笔 (11)容量瓶、烧杯、试管、移液枪(兰大一院外科实验室提供) (12)切片机、烘片机、展片机(德国Leica) (13)计算机(清华同方) (14)MIAS彩色医学图象分析系统(华西医科大学开发) (15)全自动r免疫计数仪(西安二六二厂，型号FJ一2008) (四)相关溶液的配制 (1)0．1MPBS液NaCL8．09，KCL0．209，Na。HP04·H。01．569，NaH2PO。0．209，加蒸馏 水至1000ml，封装4℃保存。 (2)4％多聚甲醛多聚甲醛409溶于500m10．1MPH7．4PBS液，加热至60。C，滴加 lmol／L的NaOH至溶液清亮，冷却后补充0．1MPH7．4PBS液至1000ml，过滤，4。C保存。 (3)2XSSC柠檬酸三钠(c。H；0。Na．，·2H：0)8．89加NaCll7．69，蒸馏水定容至1000M， 充分混匀。 (4)0．5S$C300MH20加2×SSCl00ml，充分混匀。 (5)0．2SSC270mlH：O加2×SSC30ml，充分混匀。 (6)苏木素取苏木素粉0．59和铵矾249溶于70ml蒸馏水中，然后取NaIO．；lg，加 水59，再加入甘油30ml和冰醋酸2ml混合均匀，过滤，备用。 18 兰州大学硕士学位论文 (7)1％多聚甲醛多聚甲醛109溶于500m10，1MPH7．4PBS液，加热至60℃，滴加 lmol／L的Na0H至溶液清亮，冷却后补充O．1MPH7．4PBS液至1000ml，过滤，4℃保存。