液相色谱基础知识+B

Waters中国有限公司 培训中心 液相色谱 (一) 液相色谱基础知识 B ©2004 Waters Corporation HPLC分离原理与术语 ƒ这是一张由仪器提供的示分离状况的色谱图 ƒ这张色谱图含有丰富的信息 ƒ现在我们来测量色谱图并以此对一些基本理论展开讨论 ©2004 Waters Corporation 洗脱体积和峰宽 ƒ这些是导出理论和定义所必需的基本测量 V0 = 无保留化合物的洗脱体积,等于一个柱体积 V1 = 化合物1的洗脱体积 V2 = 化合物2的洗脱体积 W2= 化合物2的峰宽(以体积计) ©2004 Waters Corporation 分离度(R)的定义式 ƒ简单说来,分离度即是两峰相对于其峰宽分开得有多远 ©2004 Waters Corporation R:分离程度的量度 ƒ此处是几个计算分离度的实例 ( )21 12 WW2 1 t tR + −= ( ) 8.5.521 1-5 tR 1-3 =+= ( ) 2.5.521 1-2 tR 1-2 =+= t0 t1 t2 t3 时间 .5 1 2 5 ©2004 Waters Corporation 容量因子(K′ ):保留能力的量度 ƒk′ 是样品与填料作用强度的直接量度 V0 V1 V2 V3  时间 .5 1 2 5 3 .5 .5 - 2 k'2 ==0V 0V1V k'1 −= :公式 1 .5 .5 - 1 k'1 == 9 .5 .5 - 5 k'3 == ©2004 Waters Corporation 分离因子(α ):峰分离程度的量度 ƒα是两个化合物在同一套色谱系统上 保留差异的数值表述 0V1V 0V2V 1k' 2k' − −=α=α 或 3 .5 - 1 .5 - 2 ==α 12/ 的峰峰 9 .5 - 1 .5 - 5 == 13/ α的峰峰 V0 V1 V2 V3  时间 .5 1 2 5 ©2004 Waters Corporation 理论塔板数(N):分离效率的量度 ƒ理论塔板数或柱效是一个数值,它表示作为保留时间函数 的峰展宽的量度 1600 N .5 516 N W V16N 2 2 =   =   = 100N 2 516N W V16N 2 2 =   =   = PW = .5 PW = 2 ©2004 Waters Corporation 分离度方程式 ( )  κ′+κ′ α−α= 1N141R 分离因子 柱效 容量因子 ƒ分离度方程式描述了分离度与选择性,柱效和容量因子之 间的关系 ƒ它是评价一张色谱图以及决定如何解决、开发和优化分离 方法的依据 ©2004 Waters Corporation 分离度方程: 容量因子项 ƒ若 κ′ = 1, 2, 10 或 20, R会如何变化? ( )        α −α= ′κ+ ′κ 1 N 1 4 1R ©2004 Waters Corporation 分离度与k′的关系 k′ 值 k′ 项 k′ 分离度? 0 0 0 1 1/2 .50 2 2/3 .67 3 3/4 .75 10 10/11 .91 20 20/21 .95 k′ k′ 理想范围 ? 分 离 度 ©2004 Waters Corporation ƒ若 α = 1.1 或 1.4, R会如何变化? 分离度方程: 分离因子项 ( )  κ′+κ′    = α−α 1N41R 1 ©2004 Waters Corporation 分离度与 α 的关系 0.29 0.09 =−= =−=    − 4.1 14.14.1 1.1 11.11.1 1 α α α α ƒ当α值很小时,其很小的改变也会引起较大的分 离度变化, 当α值很大时此项接近1. ©2004 Waters Corporation 分离度方程: 柱效项 ƒ若 N 增加 2倍 或 3倍 , R会如何变化?        α −α 1 1 4 1 N   κ′+ κ′= R ©2004 Waters Corporation 分离度与 N 的关系 ƒ分离度与理论塔板数的平方根成正比 ( ) % N N 结果塔板数 变化 73% 54.73000 3000N 41% 44.72000 2000N 31.61000 1000N ↑== ↑== == 73% 122.415,000 15,000N 41% 10010,000 10,000N 70.7 5,000 5,000N ↑== ↑== == ©2004 Waters Corporation 影响峰宽的因素 ƒ峰宽因其影响信噪比和分离度而显得很重要 ƒ为了研究塔板数和保留对峰宽的影响,我们把塔板数表达式 改写为峰宽随保留和塔板数而改变的形式   =   = 2 1 r 2 r N V4W W V16N 改写为 ©2004 Waters Corporation 峰宽与保留体积的关系 ƒ这张峰宽对保留的曲线图清楚地显示其线性关系 1000 2000 3000 4000 5000 保留体积 (µl) 50 100 150 200 250 300 N = 5000峰宽 (µl) ©2004 Waters Corporation 峰宽与塔板数的关系 ƒ峰宽与柱死体积以及k′的关系 可用另一个式子表达 ( ) ( ) 2 1 0 0r 2 1 r N k1V4 W k1VV , N V4W ′+= ′+= = 得代入则由 若 , ©2004 Waters Corporation 峰宽与塔板数的关系 2000 4000 6000 8000 0 50 100 150 200 250 300 k′ = 2, Vo = 1000 µL 峰宽 (µL) 塔板数 ©2004 Waters Corporation 不对称因子(As) A BAs = 4.4%峰高 A B ƒ不对称因子常用于测定峰拖尾 ƒ不对称因子可用多种方法测定 此处所示是典型的一种 ©2004 Waters Corporation 峰拖尾对分离度的影响 1 1.2 1.4 1.6 1.8 2 0 1 2 3 4 5 ƒ若不对称因子由1变为1.4,则柱效,N,必须增加1倍 才能保持分离度不变 0N N 10%的不对称 ©2004 Waters Corporation 等板高度(HETP)的定义 HETP = 柱长/塔板数 = L / N (HETP=Height Equivalent to a Theoretical Plate) ©2004 Waters Corporation 范第姆特(Van Deemter)方程 ƒ范第姆特( Van Deemter) 方程能够推导出流动 相的线速度对给定峰的等板高度(H)的影响. 线速度= +  += µ µ µ µ µµ C BAH 其中 : A项:叫作涡流扩散项,与填料的颗粒度及其分布和填充技术相关 B项:叫作轴向(纵向)扩散项,与流速有关 C项:叫作传质阻力项,与填料颗粒度和流速有关 ©2004 Waters Corporation 范第姆特(Van Deemter)方程 ƒ范第姆特(Van Deemter)方程的 另一种表达形式： ©2004 Waters Corporation Van Deemter 曲线 ƒ这条曲线表明随着流速的改变A,B,C三项对H的影响 ƒ最上面的虚线是其综合效应 12 C A B 线速度(µ) HETP 0 3 6 9 ©2004 Waters Corporation 塔板数与 H 和 L的关系 ƒ现在我们重新定义 HETP –变为理论塔板数的方程式 –以便研究影响理论塔板数的因素 L N H =因为 L H N =所以 ©2004 Waters Corporation 塔板数关系式(Knox方程)的推导 ƒ我们使用基于Giddings的折合参数修正的Van Deemter方程 ƒ这些修正给出用填料颗粒度和流动相的折合速度描述的塔板数 ( ) ( )v.05v2vd LNhd LN .05vvvh, D dv,d HhHETP, 3 1 p p 3 1 m p p ++== += == 则由于 范第姆特方程的吉丁斯修正 折合线速度折合 µ 2+ ƒ由此式可知:填料颗粒度dp越小,N 越大； 流动相流速V 越高,N 越大 ©2004 Waters Corporation 影响塔板数的因素 ƒ用折合速度代入,我们得到塔板数与柱长,溶剂速度, 填料颗粒度以及在流动相中的扩散速度的关系式 .05 m pm 3 1 m p p m p D d2D D d d LN D d v 2µ µ µ µ ++    = =折合速度 其中: Dm:扩散系数,dp:填料颗粒度， L：柱长，μ:溶剂线速度, V: 折合速度 ©2004 Waters Corporation 塔板数与流速的关系 塔板数 x 310 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 0 5 10 15 ƒ塔板数对线流速的曲线图 流速 (cm/min) ©2004 Waters Corporation 线速度与流速的换算 0.7 0.15 0.04 1 1.4 0.3 0.07 2 2.8 0.6 0.13 4 4.2 0.9 0.20 6 5.5 1.2 0.28 8 7.0 1.5 0.34 10 流速 4.6 mm ID 流速 2.1mm ID (mL/min) 流速 1.0mm ID mL/min 线速度 mm/sec u (mm/s) 2.1 x 20 mm, 1.7 µm 2.1 x 20 mm, 2.5 µm 2.1 x 20 mm, 5 µm 0 2 4 6 8 10 12 14 0.000 2.000 4.000 6.000 8.000 10.000 12.000 H E T P ( µ m ) UPLC™ Range LC/MS “Narrow-bore” 液相色谱教程 (一)液相色谱基础知识 B HPLC分离原理公式与术语 洗脱体积和峰宽 R:分离程度的量度 容量因子(K? ):保留能力的量度 分离因子(? ):峰分离程度的量度 理论塔板数(N):分离效率的量度 分离度方程式 分离度方程: 容量因子项 分离度与k?的关系 分离度方程: 分离因子项 分离度与 ? 的关系 分离度方程: 柱效项 分离度与 N 的关系 影响峰宽的因素 峰宽与保留体积的关系 峰宽与塔板数的关系 峰宽与塔板数的关系 不对称因子(As) 峰拖尾对分离度的影响 等板高度(HETP)的定义 范第姆特(Van Deemter)方程 范第姆特(Van Deemter)方程 Van Deemter 曲线 塔板数与 H 和 L的关系 塔板数关系式(Knox方程)的推导 影响塔板数的因素 塔板数与流速的关系 线速度与流速的换算