新疆察吾呼沟古代居民线粒体DNA序列多态性分析

© 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 　第 43卷 　第 4期 吉 林 大 学 学 报 ( 理 学 版 ) Vol. 43　No. 4 　2005年 7月 JOURNAL OF J IL IN UN IVERSITY ( SC IENCE ED ITION) July　2005 研究简报 新疆察吾呼沟古代居民线粒体 DNA序列多态性分析 谢承志 1, 2 , 刘树柏 2 , 崔银秋 1, 2 , 朱 　泓 1 , 周 　慧 1, 2 (1. 吉林大学 边疆考古中心考古 DNA实验室 , 长春 130012; 2. 吉林大学 生命科学学院大分子实验室 , 长春 130021) 摘要 : 从距今 2 500～3 000年的新疆察吾呼沟墓地的 9例古代人骨中成功地提取出古 DNA 分子. 用 4对套叠引物对线粒体 DNA高可变 Ⅰ区进行了 PCR扩增和测序 , 得到 9个 364 bp 的线粒体序列. 从 GenBank搜索其共享序列并与欧洲、亚洲序列进行系统发育分析 , 结果表 明 , 早在青铜至早期铁器时代 , 在我国新疆天山中部地区已经有蒙古人种存在. 察吾呼沟古 代居民应是一个欧洲和东亚人种混合的古代群体. 关键词 : 察吾呼 ; 古 DNA; 序列分析 ; 多态现象 中图分类号 : Q987 　　文献标识码 : A　　文章编号 : 167125489 (2005) 0420538203 Analysis of M itochondria l DNA from the Ancient Tombs of Chawuhu X IE Cheng2zhi1, 2 , L IU Shu2bai2 , CU I Yin2qiu1, 2 , ZHU Hong1 , ZHOU Hui1, 2 (1. A ncien t DNA Labora tory, Center of B order A rchaeology, J ilin U niversity, Changchun 130012, China; 2. M acrom olecu lar L abora tory, College of L ife Science, J ilin U niversity, Changchun 130021, China) Ab s trac t: The DNA was successfully extracted from the human bone samp les excavated from the ancient tombs of Chawuhu, which has been dated back to 2 500～3 000 years ago according to the feature of pottery and a series of 14 C data. Part of the m itochondrial hypervariable region Ⅰ ( 364 bp ) was amp lified and sequenced with four overlapp ing p rimers. In order to search their sharing sequences and determ ine their pedigree, each sequence was searched and compared with the database GenBank. Phylogenetic analysis indicated that there existed the adm ixture of Euro2A sian lineage in the east of Xinjiang p rior to the time of the B ronze Age. Key wo rd s: Chawuhu; ancient DNA; sequence analysis; polymorphism 收稿日期 : 2004211202. 作者简介 : 谢承志 (1979～) , 男 , 汉族 , 博士研究生 , 从事分子进化研究 , E2mail: xiechengzhi7250 @ sina. com. 联系人 : 周 　慧 (1954～) , 女 , 汉族 , 教授 , 博士生导师 , 从事分子进化研究 , E2mail: zhouhui@mail. jlu. edu. cn. 基金项目 : 教育部科学技术重大项目基金 (批准号 : 00207) .古 DNA分子经历了漫长的历史年代 , 由于高度降解 , 广泛损伤 , 仅以几百个碱基对的小片段存在 [ 1, 2 ] , 因此 , 选择待扩增片段时必须考虑其在细胞中的拷贝数 , 以提高扩增的成功率. 线粒体 DNA(m tDNA )在每个细胞中有 2 000个拷贝 , 其进化速率比核 DNA快 10～20倍 , 在群体内变异大 , 而且主要遵从母系遗传方式 , 不发生重组 , 这就为研究人类群体间的亲缘关系和群体内的遗传分化提供了一个理想的遗传标记 [ 3, 4 ] .察吾呼沟古代大型氏族墓地的发掘是新疆史前考古中规模最大的一次田野考古发掘工作. 根据14 C测定数据 , 其年代距今 2 500～3 000年. 这是迄今为止新疆地区发现的文化特征明确、文化内涵最丰富、时代最早的考古学文化. 本实验对采自察吾呼沟墓地的 9个骨样本的 m tDNA D环高可变 Ⅰ区( hypervariable region Ⅰ, HVRⅠ)序列进行了测定和分析. © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 1　材料与方法 1. 1　骨样本采集 　由新疆文物考古所提供 , 均为保存完好的密质骨. 察吾呼沟 Ⅰ号墓地样本编号为 ⅠM 319: D和 ⅠM 277; Ⅲ号墓地的样本编号为 ⅢM 002: B; Ⅳ号墓地样本分别为 ⅣM 154: B , ⅣM 172: A , ⅣM 161: B , ⅣM 201: C, ⅣM 094: A , ⅣM 125: A. 1. 2　骨样本处理 　先用刀片和毛刷去除骨样表面污垢 , 然后将样本在紫外光下暴露 1 h, 打磨去表面 2～3 mm的薄层 , 用打磨机 W aring B lender(美国 W aring公司 )将骨样粉碎成骨粉. 将骨粉分装于经灭 菌的 5 mL Eppendorf管中 , - 20 ℃贮存. 1. 3　DNA的提取、扩增及测序 　按照 GENECLEAN ( r) for Ancient DNA 试剂盒 (美国 B IO101公司 )的 标准操作进行 DNA提取 ; 利用 4对套叠引物对线粒体 DNA上长度为 364 bp的片断进行 PCR扩增 , 每 次 PCR反应均设空白对照 ( PCR及抽提对照 ) ; PCR扩增产物采用 2%的琼脂糖凝胶电泳 , 经 Q IAEX Ⅱ GEL Extraction Kit(德国 Q iaGen公司 )胶回收试剂盒回收纯化. 检测后以回收产物作为模板直接测 序 , 经 AB I 310全自动基因分析仪读取序列. 为得到真实可靠的古代 DNA序列 , 在样本抽提和扩增过程中 , 设立抽提空白对照和 PCR阴性对 照. 设计了重复实验 , 对相同样本在不同时间和地点进行独立的重复试验 , 排除外源污染的可能. 2　结果与讨论 通过重叠 PCR方法成功测定了察吾呼沟 9个样本的 m tDNA D环高可变 Ⅰ区 364 bp的序列 , 与剑 桥标准序列相比 , 共检测出 11个变异位点 (见表 1). 所有变异位点均为核酸取代 , 无插入和缺失现 象. 这些取代都是转换 , 无颠换发生. 其中 T/C占 72. 7% , A /G占 27. 3% , 嘧啶碱的变异率明显高于 嘌呤碱. 察吾呼人群的 m tDNA高可变 Ⅰ区的 9个序列在 GenBank中 , 通过 BLAST寻找到的共享序列都属 于现代人群 (见表 1). 其中 3号的共享序列在东亚地区的中国和韩国 , 为亚洲谱系序列 ; 2号、4号、 5号和 9号样本的共享序列则主要分布在欧洲内陆、俄罗斯的西西伯利亚地区、阿拉伯地区 , 这些序 列应为欧洲谱系的序列. 1号、6号、7号和 8号未找到完全共享序列 , 但与 1号样本相差一个碱基的 都集中在中国 , 而 6号、7号和 8号相差一个碱基的都出现在欧洲. Table 1　Polym orph ic nucleotide sites of m tD NA HVRⅠ A rchaeological　 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 Sharing number　 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 6 populations 0 0 1 1 1 2 2 2 3 3 3 8 9 2 4 7 0 2 6 1 1 6 6 3 9 0 9 7 3 0 1 9 2 CRS3 t t g t c a c c t g t 1 ⅠM 319: D t t g c t a t t t a t 　None 2 ⅠM 277 t t g t t a c t t g t 　European 3 ⅣM 154: B t t g t c a t c t g t 　Eastasian 4 ⅣM 172: A t t g t c a c t t g t 　European 5 ⅣM 161: B t t g t c a c c c g t 　European 6 ⅣM 201: C t c a t c a t c t g t 　None 7 ⅣM 094: A c t g t c a c c t g c 　None 8 ⅣM 125: A t t g t c g c t t g t 　None 9 ⅢM 002: B t t g t c a c c t g c 　European 　　3 CRS means the Cambridge reference sequence, which was published by Anderson. 将察吾呼样本序列、欧洲和亚洲序列一起用 Kimura 22参数模型 (MEGA )构建邻接 (Neighbor2join2 ing)系统树 , 其结果如图 1所示. 所采用的亚洲谱系包括中国北方汉族 [ 5 ]的 128个序列 , 韩国 [ 6 ]的 64 个序列以及蒙古 [ 7 ]的 83个序列 ; 欧洲谱系序列包括英国 [ 8 ]的 100个序列、瑞士 [ 9 ]的 74个序列、意大 利 [ 10 ]的 91个序列. 在图 1中 , 欧洲谱系和亚洲谱系的聚类簇明显分开 , 察吾呼序列 (●)分散在欧洲 (○)和亚洲 (△)的群体序列之中. 其中 1号和 3号序列分布在亚洲谱系的聚类簇中 , 2号 , 4～9号序 935　第 4期 　　　　　　谢承志 , 等 : 新疆察吾呼沟古代居民线粒体 DNA序列多态性分析 　　　 © 1994-2010 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net F ig. 1　Ne ighbor2jo in ing tree of European, A sian and Chawuhu sequences 列分布在欧洲谱系的聚类簇中. 结合共享序列 分布情况 , 1号和 3号序列应属于亚洲谱系. 2号 , 4～9号个体的序列应属于欧洲谱系. 根据 Cavalli2Sforza的三角法 , 可以计算出 察吾呼沟古代居民的混合度. 在假设两个祖先 人群 A, B 和混合人群 M 进化速率相同的情况 下 , 由人群 A 贡献给人群 M 基因的比例表示 为 : M = 1 /2 + [ ( fBM - fAM ) /2 ] fAB , 其中 fAB为 A, B 两个祖先人群之间的统计频率 距离 , fAM和 fBM为每个祖先人群和混合人群之 间的统计频率距离. 计算结果为 : 亚洲序列在 察吾呼沟古代居民中的比例为 37. 5% , 欧洲序 列在察吾呼沟古代居民中的比例为 62. 5%. 新疆自古以来就是多民族聚居地区 , 在古 代亚欧大陆的历史文明进程中具有特殊地位. 在本实验的 9个古 DNA序列中 , 7个序列分布在欧洲谱 系范围 , 属于欧洲谱系 ; 2个序列分布在亚洲谱系范围 , 属于亚洲谱系. 察吾呼古代居民同时具有两者 序列 , 表明察吾呼沟古代居民的线粒体 DNA序列中包含了欧罗巴和蒙古人种两类基因来源 , 察吾呼沟 古代居民是一个欧洲和东亚人种混合的古代群体. 这是该时期继新疆吐鲁番盆地和哈密等地区的分子 人类学发现以外 , 又一重要的分子生物学证据. 参 考 文 献 [ 1 ]　J IN Hai2yan, ZHANG Quan2chao, YU Bo. Determ ination of Trace Elements in B ronze Age Human Bone in Xinjiang by ICP2AES [ J ]. Journa l of J ilin U niversity (Science Edition) , 2003, 41 (2) : 228—230. 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