流行性感冒病毒灭活疫苗规模化生产工艺的建立

流行性感冒病毒灭活疫苗规模化生产的建立 Ξ 王 　辉 ,李克寒 ,乔建英 ,胡文权 ,张振萍 ,张 　宏 (兰州生物制品研究所 ,兰州 　730046) 摘 　要 :本文了流行性感冒病毒疫苗规模化生产工艺的建立及结果。用鸡胚分别接种 A1 ,A3 ,和 B 型病毒株 , 培养后进行了纯化、配苗及检定。对培养时间、收获量、离心分离及纯化、灭活、脱糖等重要步骤进行了优化比较。 结果明 ,培养 66 小时病毒滴度及收获量达到最高 ;采用蔗糖密度梯度离心可收到理想的分离效果 ;超滤脱糖优 于透析法 ;β2丙内酯在生产中是一种理想的灭活剂。并依此筛选出最优化工艺配置 ,建立了切实可行的疫苗规模生 产工艺 ,成功制备了质量稳定、安全可靠的疫苗制剂。 关键词 :流感病毒 ;疫苗制剂 ;纯化 ;工艺 中图分类号 :R37311 + 3 　　　文献标识码 :A 　　　文章编号 :100525673 (2002)20120023205 Establishment of process to produce vaccine of influenza virus 　W A N G Hui , L I Ke2han , QIA O Jain2yin , et al . ( L anz hou Institute of Biological Products , L anz hou 730000) Abstract : Establishment of process to produce in activated vaccine of influenza virus in a large scale was reported in this paper. The embryonated hen eggs that was infected by three types of influenza virus ,A1 ,A3 ,B ,respectively were cultivat2 ed. Influenza virus was separated from the virus infected allantoic fluid and then ,it was purified ,formulated and measured. Many important steps , such as duration of culture ,yield , separation ,purification , ,inactivation were compared and opti2 mized. According to the results of experiment on which the most optimal process for vaccine preparation was set up ,and safe ,and high quality vaccine preparation was produced. Key words : Influenza virus ; Vaccine preparation ; Purification ; Process. 　　流行性感冒是主要由流感病毒引起的急性呼吸 道传染病 ,它有着在任何季节里突然暴发大流行、迅 速蔓延、影响面广、发病率高并伴有并发症及一定的 死亡率。特别是机关团体 ,学校、医院等人群密集范 围内其发病率可达 80 %～100 % ,但对其治疗却无 特效药物 ,疫苗接种是预防流感流行的最有效的措 施。因此疫苗的研究有着重要的意义。由于流感病 毒易受外界环境的影响发生抗原变异 ,因此世界卫 生组织发展了一个国际性检测网 ,每年进行全球监 测并发布当年流行病毒株 ,对于没有任何抵抗能力 的人群来说用抗原性强 ,纯度高 ,毒性低 ,免疫力强 及具有较高安全性并符合规程要求的疫苗来预防流 感显得特别重要〔123〕。本文主要报告了用鸡胚培养 流感病毒 ,收取病毒培养液并进行纯化的工艺流程 , 制备出疫苗。其收率有较大提高。 和 1 　材料 111 　毒种 由国家流感中心根据 WHO 发布的当年流行代表株提供的相似株供每年生产使用 ,主要有 A1/ 上海/ 7/ 99 ,A3/ 深防/ 1/ 99 和 B/ 深防/ 423/ 99 三个型2000 年流行株。112 　试剂及实验动物蔗糖由北京化工厂购进 ,β2丙内脂由 SIGMA 公司进口 ,PBS 缓冲液经兰州生物制品研究所质管处检验合格的化剂配制。9～10 日龄鸡胚 ,由兰州生物制品研究所实验动物室提供。2 　试验方法211 　鸡胚培养不同时间病毒的收获量试验将工作种子库毒种 A1 ,A3 和 B 三种类型病毒分别接种于 9～10 日龄鸡胚尿囊腔 32～34 ℃培养48～80 h ,用直接血凝法测定后 ,收取鸡胚尿囊液及羊水 ,比较不同时间病毒的收获量。212 　离心纯化试验合格的单价病毒液浓缩后以蔗糖速率区带超速离心〔4〕。以核酸蛋白检测仪描记样品在 280 nm 处 32微生物学免疫学进展 2002 年第 30 卷第 1 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 Ξ 作者简介 :王辉 (19632) ,女 ,大学本科 ,医学生物工程师 ,主要从事流感疫苗的生产工艺开发及管理工作。 的吸收曲线 ,出样后用直接血凝法检测样品的效价 并测量蔗糖浓度 ,根据血凝滴度收取有效成分 ,以高 效液相色谱检测其纯度 ,电镜下观察流感病毒形态。 213 　灭活试验 在纯化后的病毒蔗糖液中加入一定浓度的β2丙 内脂于 20 ℃灭活〔5〕,灭活后放置 4 ℃,最终以气相色 谱仪检测制品中是否存在β2丙内酯。 214 　脱糖试验 以透析法与超滤法比较 ,选择一种适合规模化生产的方法〔6〕。215 　除菌及半成品检定疫苗最终以除菌膜过滤 ,并按照规程要求进行检定〔7〕。结 　果1 　鸡胚培养不同时间病毒的收获量 表 1 　不同时间鸡胚收获量结果 Table 1 Yield of virus fluid in different culture of time Type 48h 66h 80h HA Yield (ml. egg) HA Yield (ml. egg) HA Yield (ml. egg) A121 1∶320 719 1∶480 813 1∶480 314 A122 1∶280 815 1∶480 815 1∶480 414 A123 1∶280 818 1∶480 814 1∶320 513 A321 1∶280 813 1∶320 817 1∶320 316 A322 1∶240 718 1∶320 719 1∶320 419 A323 1∶240 813 1∶280 813 1∶240 516 B21 1∶140 811 1∶240 814 1∶240 314 B22 1∶160 815 1∶240 817 1∶280 519 B23 1∶200 813 1∶240 813 1∶240 610 　　从表 1 可以看出 66 h 培养的鸡胚其血凝效价 和每胚收获量比其他两组高。 2 　单价病毒液离心纯化结果 超滤后的单价病毒液进行蔗糖梯度离心 ,蔗糖 溶液浓度 30 %～55 % ,25000 r/ min ,15 ℃下 8 h 离 心后于 A280 分管分样测定样品中的血凝滴度 (RPHA) ,阿贝折射仪检测样品中的蔗糖浓度 ( %) , 从图 1、2、3 中可以看出 ,蔗糖梯度离心后出现三个 峰 ,第一峰为鸡胚卵清蛋白及小分子杂蛋白颗粒。 第二峰电镜检查结果为有结构的病毒颗粒 ,表明为 流感病毒颗粒峰〔8〕。第三峰为大分子杂蛋白 ,电镜 下未见流感病毒颗粒 (见图 1、2、3) 。 高效液相色谱显示出现完整的一个峰 ,未见其 他杂蛋白峰 ,在出样末端有微小波 ,计算病毒液纯度 可以达到 85 %以上 (见图 5) 。 3 　透析法与超滤法结果 　　表 2 中显示超滤法脱糖其无菌试验合格率及血 凝素含量高于透析法。 4 　灭活后残毒毒性试验 　　将离心纯化后病毒液加不同浓度β丙内脂灭 活 ,不同时间内取样 ,测定其残毒活性 ,选择一种适 当的灭活方法 :见表 3 42　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　微生物学免疫学进展 2002 年第 30 卷第 1 期 表 2 　透析法与超滤法结果比较 Table 2 Comparison of results of ultrafitration and dialysis Type Ultrafitration Dialsis p H HA (μg·ml) Sterility Test Yield rate p H HA (μg·ml) Sterility Test Yield rate A121 712 50 - 85 711 48 - 70 A122 7116 64 - 90 6198 35 + 65 A123 713 68 - 78 710 31 + 53 A321 711 71 - 79 712 67 - 80 A322 7115 78 - 86 713 79 - 70 A323 712 89 - 89 7116 83 - 30 B21 7126 65 - 95 712 32 + 49 B22 7136 69 - 90 6178 66 - 66 B23 7145 63 - 91 7117 68 - 78 表 3 　β2丙内脂不同时间灭活残余毒性试验结果 Table 3 Residnal virulence of inactivated virus by using differentβ2Propiolactoal at different time Type 1∶2000 1∶4000 1∶6000 24h 48h 72h 24h 48h 72h 24h 48h 72h A121 + - - + - - + + - A122 - - - + - - + + - A123 + - - + - - + + - A321 - - - + - - + + - A322 - - - + - - + - - A323 - - - + - - + + - B21 - - - + - - + + - B22 + - - + - - + + - B23 + - - + - - + + - 52微生物学免疫学进展 2002 年第 30 卷第 1 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　 　　从表 3 显示出 :1∶2000 和 1∶4000 ,48 h 和 72 h 均能达到灭活效果 ,电镜观察表明病毒颗粒受损、形 态发生变化。第三组 1 ;6000 ,72 h ,既达到完全灭活 效果 ,又不损伤病毒的抗原性和免疫性。 5 　三价疫苗液中灭活剂检测 离心纯化后的病毒液加适当量的灭活剂放置一 定时间后 ,检测疫苗中是否存在β2丙内脂。试验分 两组 ,对照组 :1∶2000 和 1∶6000β2丙内脂稀释原液 , 试验组 :疫苗液 (20010201 20010202 20010303) 。 对照组进样后均出现β2丙内脂专一峰 ,而试验 组全程未出现β2丙内脂专一峰。证明疫苗液中已不 存在灭活剂。 6 　单价疫苗液纯度结果 对单价疫苗合并液进行纯度检查 ,液相色谱显 示纯化后其单价苗的纯度可以达到 85 %以上 ,如图 4 所示。 图 4 　流感疫苗纯度检查结果 Fig. 4 The results of Influezae vaccine 7 　三价疫苗液检定结果 6 批三价疫苗液的检定结果如下 : (见表 4) 表 4 　三价疫苗液检定项目及结果 Table 4 Control result of the final bulk lot No. Objects of inspection HA (μg/ ml) Sterility test Total proteins (μg/ ml) Formaldehyde Merthio2 late Egg albumin (μg/ ml) Toxicity Test Pyrog2 en Test 20010201 3719 - 98 01005 pass 0136 pass - 20010202 4012 - 78 01005 pass 0. 36 Pass - 20010303 3816 - 78 01001 pass 0172 Pass - 20010304 3716 - 69 01005 pass - Pass - 20010305 4115 - 88 01001 pass - Pass - 20010406 37. 2 - 69 0. 001 pass 1. 36 Pass - 　　表 4 结果表明 :半成品检定抗原含量均 ≥36 μg/ ml ,总蛋白含量 ≤300μg/ ml ,残余卵清蛋白 ≤ 1136μg/ ml ,其余异常毒性试验 ,残余甲醛、硫柳汞 含量及无菌试验均符合世界卫生组织规程及中国生 物制品规程要求。 讨 　论 通过对建立的流行性感冒病毒灭活疫苗进行的 各项生产工艺及各种检定试验 ,证明此生产工艺均 具有明显的技术优势和切实可行性。生产的疫苗安 全和效力及各项指标均符合世界卫生组织流感疫苗 规程和中国生物制品规程要求。 从单价病毒液不同时间检定结果证明了 66 h 收获的病毒液其病毒滴度及收量最高。最有利于产 量的增加。 梯度离心结果显示各分子量颗粒分离的较明 显 ,有效峰为一个独立峰 ,未与杂蛋白峰交叉 ,经电 镜检查证实有效峰内不含有其他杂蛋白 (见图 5) 。 离心后并液直接血凝效价 ≥1∶1280 ,说明分离效果 较好。由于蔗糖粘度大 ,离心时为保证分离效果 ,离 心过程梯度液分配须要准确 ,严格控制进出样流 速〔9〕。 62　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　微生物学免疫学进展 2002 年第 30 卷第 1 期 图 5 　流感病毒的电子显微镜照片 Fig. 5 Transmission electron micro photograph of Influenza Virus 　　从透析法和超滤法的比较试验中可以看出 ,透 析法由于操作程序复杂 ,时间长而难以控制无菌 ,污 染率的升高造成抗原的损失 ,合格率 67 %。超滤法 使无菌试验的合格率从 67 %提高到 95 %以上。血 凝素含量从 60μg/ ml 提高到 6818μg/ ml。 灭活实验结果表明 1 ;6000 ,72 h ,能够较理想的 达到完全灭活效果 ,不损伤病毒的抗原性和免疫原 性。灭活剂浓度β2丙内脂的灭活力是甲醛的 25 倍 , 是流感疫苗生产中的理想灭活剂。 气相色谱检测证实疫苗中加入灭活剂后 ,其半 衰期 10 ℃下为 18 h。放置一定时间后灭活剂就完 全水解为对人体无害的β2羟基丙酸 ,为人体酯肪代 谢产物。 流行性感冒病毒灭活疫苗规模化生产中采用新 的生产工艺 ,最终以除菌膜过滤 ,无菌试验合格率达 到 95 %以上 ,配制的三价疫苗计六批的检定均符合 世界卫生组织《生物制品规程》及国家生物制品试行 规程要求。 参考文献 : 〔1〕　Fred M D ,Albert V H ,Frank M. 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