药物中有机残留溶剂的测定方法概述

药物中有机残留溶剂的测定方法概述 张俊伟 (天津药物研究院制剂研究及工程中心 　天津 　300193) 摘 　要 　本文综合介绍各种药物中残留溶剂测定的多种方法 ,包括气相色谱法、紫外分光 光度法、高效液相色谱法剂及多种方法的联合应用等。 关键词 　药物 　残留溶剂 　测定方法 　　药品中的残留溶剂是指在合成原料、辅料或制剂 生产过程中使用或产生的挥发性有机化学物质。他 们在生产过程中未能被全部清除 ,服用后对人体有毒 性和致癌作用 ,近年来日益引起各方面的重视 ,在新 药研究中要求越来越严格。从 1994 年起 , ICH(人 用 药物技术要求国际协调会议)着手编撰关于溶剂残留 量的指导原则。1997 年美国 FDA 根据此原则发布题 为“杂质 :残留溶剂 (Q3C) 的指导原则 (草案)”。ICH 程序委员会广泛征求意见后通过此原则 ,欧盟、美、日 三方签字后正式生效1。我国在 1995 年药典也规定 7 种限制溶剂残留项2 ,在 2000 年药典中3 ,根据 ICH 的 限度要求对这 7 种溶剂残留限量进行调整。ICH 要 求检测的溶剂就有 69 种 ,虽然我国药典并未要求按 ICH的规定实施 ,但在新药研究中对于残留溶剂的要 求事实上是参照 ICH 的规定执行的。这是 SDA 对新 药研究从严从高要求的体现 ,也是与国际接轨 ,适应 WTO规则的需要。在实际工作中 ,药品的合成、制 剂、消毒工作涉及到的有机溶剂有上百种 ,气相色谱 法是中国药典对有机残留溶剂测定的法定检测方法 , 也是检测有机溶剂的最常用、最适用的方法之一 ,但 其他现代分析手段的应用 ,比如比色法、HPLC 法、核 磁共振法、热重分析法以及多种方法联合应用 ,是对 气相色谱法的补充 ,也是残留溶剂测定新方法有益尝 试。最近十多年 ,残留溶剂测定的文献报道越来越 多 ,为加强学习 ,也为使初学者对残留溶剂的测定方 法有一个全面的了解 ,作者查阅各种文献 ,结合自己 的工作经验稍做总结 ,对残留溶剂的测定方法作一简 要介绍 ,希望能给读者一点启示。 1 　气相色谱法 111 　样品的处理 一般是将样品溶于适当的溶剂中 ,能达到的浓度 越高越好 ,以利于残留量极微溶剂的测定。由于样品 复杂多样 ,为提高样品浓度 ,所用溶剂也是多种多样。 一般常用溶剂为水、二甲基甲酰胺 (DMF) 、二甲亚砜 (DMSO) ,也有用四氯化碳4、二甲基乙酰胺、乙醇5、正 己烷、二氧六环、乙酸、甲氧基乙醇6、氢氧化钠溶液7、 十二烷基磺酸钠溶液8 等的 ,不一而足。大部分为单 独使用 ,也有的混合使用 ,主要目的就是增加样品溶 解度。所用溶剂与所测溶剂应达到较好的分离。其 中二甲基甲酰胺、二甲亚砜因其溶解范围广 ,溶解性 好 ,素有“万能溶剂”之称 ,是最常用的溶剂。 需要注意的是 ,样品一定要溶清 ,保证所测组分 都溶解在溶剂中。在一段时间里 ,曾将不溶性样品 用水等溶剂超声提取、离心 ,取上清液进样9 ,10 ,后来 发现这样不能提取完全 ,影响测定结果 ,不尽合理。 所以在后来的新药报批中均要求将样品溶清后进 样 ,这在溶剂残留测定中是一大发现和进步。直接 进样的样品取一定量溶液进样测定即可 ,顶空进料 的样品需要在进样前保温一定时间 ,使气液或气固 两相达到分配平衡 ,然后再进行测定。 对于液体样品来说 ,可以将对照品定量加入到 样品中制成对照品溶液 ,与样品溶液同时进样 ,要求 样品溶液的残留溶剂峰面积的两倍不得超过对照峰 面积。蒋海松、关大卫用此法测定壬苯醇醚中二恶 烷的残留量11 ,何培孝、樊庆银测定壬苯醇醚中二氧 六环的限量12 ,结果与部颁标准一致 ,相比而言方法 更加简便、准确、可靠。 有的样品需要经过萃取、吹扫 - 捕集等富集 ,浓 缩方法处理 ,使待测组分达到一定的浓度后再进样 测定 ,可以使结果更准确 ,一般用于微量残留溶剂或 限度要求较高的溶剂如苯的测定。蔡春、关景华用 吹扫 - 捕集方法13 ,测定硬膏剂中甲苯残留量。具 有自动化程度高 ,回收率好等优点。陈晓莉在吉非 罗齐中残留醚化物及其它杂质的定量分析中 ,先将 样品溶解于氢氧化钠溶液中 ,再用正己烷提取 ,取得 满意的结果14。 112 　定量方法 用色谱峰定量的标准技术分为四种15 ,分别为 面积归一化法、标准物添加法、外标法、内标法。前 01 现代仪器 二 ○○四年·第三期 两种方法很少见到 ,一般用后两种方法。中国药典 2000 年版规定两种方法均可 ,美国药典 24 版 (US2 PXXIV) 16、英国药典 2000 年版 (BP2000) 17均要求用 外标法。 内标法不要求所有组分都完全分离、流出和检 测出来。它只需将要分析的峰与内标物完全分离即 可。内标物必须符合下列要求 :在样品中原来没有 内标物的存在 ;内标物必须与所有样品组分完全分 离 ;内标物的流出时间应尽量接近待分析组分 ;内标 物应与待分离的物质具有相近的浓度、物化特性和 检测器的响应值 ;内标物必需稳定、不起化学反应、 纯度高、挥发性应很低以允许长期保存并且在注样 过程中损失最小。待测样品可以是一个或一个以 上。本方法可以消除仪器与操作造成的误差。 外标法是用待测组分的峰面积和峰高与一系列 已知的 (或外加的)标准样相比较。标准浓度与待测 组分浓度的浓度量级应相同。样品与标准品进样浓 度与色谱条件应完全一致 ,标准曲线的浓度范围应 包括全部样品中待测溶剂的浓度。标准曲线应由同 样体积的标准物作出。一般适用于进样重复性较好 的样品。 113 　进样方式 气相色谱法的进样方式一般分顶空进样和直接 进样两种。 顶空进样又分为溶液顶空和固体顶空。前者就 是将样品溶解于适当溶剂中 ,置顶空瓶中保温一定 时间 ,使残留溶剂在两相中达到气液平衡 ,定量取气 体进样测定。固体顶空就是直接将固体样品置顶空 瓶中 ,置一定温度下保温一定时间 ,使残留溶剂在两 相中达到气固平衡 ,定量取气体进样测定。在文献 报道中 ,溶液顶空应用较多 ,而固体顶空应用较少。 一般进样体积 2mL 以下。 近年来顶空进样法的应用越来越多 ,其优点是 可以使残留溶剂气化后进样 ,浓度与溶液相比有很 大增加。进样室在较低温度下操作 ,可避免组分分 解。顶空进样也可大大减少溶解样品的溶剂和样品 本身对色谱系统带来的干扰和污染 ,缩短分析时间 , 增加柱子寿命 ,而且提高样品的重现性18。但是顶 空进样只对那些蒸汽压足够高以至他们在顶空中的 浓度大到足以使检测器有响应的物质才能产生色谱 峰。加大进样量虽可以增加较不挥发物质的量 ,但 会带来峰变宽或重叠、分离度变差等问题 ,所以一般 只应用于沸点 100 ℃以下的低沸点溶剂19。 另外 ,一般顶空进样都需要采用自动的顶空进 样器 ,费用昂贵 ,成本较高。董英、战祥友自制顶空 装置20 ,顶空法测定胆红素中乙醇和氯仿的残留量 , 孟德贤、郭向勇用自制的顶空瓶测定合成药佐匹克 隆中的残留溶剂21 ,测定结果满意 ,可以借鉴。 吕志华等分别用溶液顶空和固体顶空的方法比 较22 ,测定几丁糖酯中的乙醇、丙酮的溶剂残留量 , 两种方法测定结果一致 ,经显著性检验无显著差别。 在本试验中顶空进样法检测限低 ,精密度高 ,主要是 因为以水为溶剂进行的顶空进样受平衡温度波动的 影响较大。王伟、韩光智用气固顶空法测定伊索拉 啶中乙醇的残留量 ,方法可靠准确23。 固体顶空不受样品溶解度影响 ,适合蒸汽压高、 沸点低、含量低的残留溶剂且不易溶解的样品。 在用毛细管柱时 ,一般又选择分流法进样。分 流法是指在气化室出口分两路 ,绝大部分放空 ,极小 部分进柱子。这两部分比例叫分流比。又分为动态 进样和静态进样 ,一般应用较多的是动态进样24。 溶液直接进样是指将样品定量溶解于适当溶剂 中 ,准确量取适量注入气相色谱仪测定溶剂残留量 的进样方法。进样体积一般为 2μL 以下。本法为通 常采用的方法 ,适用于受热不易分解的样品 ,约占发 表文章总数的四分之三。 溶液直接进样的方法绝对进样量大 ,可以弥补检 测器灵敏度的不足 ,操作也简便易行。最大的缺点是 污染进样口和色谱柱 ,需要及时清洗。另外由于进样 量大 ,除溶剂峰响应值大 ,分析时间较长外 ,还有各种 分解产物和溶剂杂质峰干扰测定。一般需选用程序 升温快速除去溶剂并选用纯度较高的溶剂。 但在毛细管柱的应用中 ,本方法的长期使用有 可能堵塞毛细管柱口而使色谱柱无法正常使用 ,姚 倩、李章万、张强等在建立大口径毛细管柱测定药物 中有机溶剂残留方法的研究中25 ,利用自制的玻璃 二通接口在分析柱前接一根 3～5m 长的空心未涂 层大口径毛细管柱作为前柱 ,使样品中难挥发成分 保留在前柱中 ,避免了它们对分析柱的污染 ,当色谱 峰形变差时 ,更换前柱。创造性的解决这个问题。 中国药典 2000 年版、美国药典 24 版 ( US2 PXXIV) 、英国药典 2000 年版 (BP2000)规定溶液直接 进样与顶空进样两种方法均可。 114 　色谱柱的选择 气相色谱柱是样品中残留溶剂测定的理论与物 质基础 ,所以对色谱柱的选择也是最关键的步骤。 气相色谱柱可分为填充柱和毛细管柱两大类 , 其中填充柱又分玻璃柱和不锈钢柱 ;毛细管柱按柱 11 二 ○○四年·第三期 综述与专论 口直径一般又有 0153mm 和 0132mm 两种规格 ,前者 又叫大口径毛细管柱 ,柱容量大 ,在残留溶剂测定中 应用较多。由于毛细管柱造价高 ,中国药典 2000 年 版结合中国国情 ,用填充柱测定 ,美国药典 24 版 (USPXXIV)和英国药典 2000 年版 (BP2000)要求用毛 细管柱。 从填料来分 ,填充柱一般选用高分子多孔小球 系列 ( GDX101 , GDX102 , GDX103 , GDX301 , GDX401) 直接测定。GDX 的表面积大 (1～500m2/ g) ,有一定 的机械强度 ,可在 250 ℃以下应用。无论极性还是 非极性物质 ,在这种固定相上的拖尾现象都降到最 低限度 ;它和羟基的化合物亲和力极小 ,可使水、醇 类物质大大提前流出柱子 ;氧化氮、HCN、NH3、SO2、 COS等活泼气体可以很快流出 ,不干扰测定 ,这些优 点对残留溶剂测定来说是比较理想的。这类填料的 应用约占填充柱测定残留溶剂的文献的 90 %。 GDX既是性能优良的吸附剂 ,能直接作为气相 色谱的固定相 ,直接用于气固分析 ,也能作为担体涂 布 PEG系列 (PEG20M ,PEG2M ,PEG10000 ,PGE5000) , DEGS(丁二酸二乙二醇酯) ,DG(缩二甘油) ,丙二醇 乙二酸聚酯 ,OV - 225 ,SE52 (苯基甲基硅酮) 等固定 液 ,用于残留溶剂测定 ,当然担体的选择也有多种 , 如 6201、硅藻土、Porapark Q 等。 在柱子的选择上 ,一般选用 GDX 系列就能解决 问题 ,但对于某些样品 ,就需要用某些固定液来进行 分离才能满足要求 ,如二甲基甲酰胺26。选择原则是 相似相溶 ,对于醇、胺等能形成氢键的物质 ,除上面介 绍的 GDX外 ,也可选择极性固定液。另外也可将不 同极性的固定液混合涂布在担体上进行分离27。 毛细管柱的种类也很多 ,如 OV - 101 ,SE - 54 , CP - Sil - 5CB28 ,AC - 20 ,SE - 30 ,HP - 5 ,HP - 20M , 100 %二甲基硅氧烷 ,AT - 624 ,TFAP 等 ,一般长 10～ 30m 不等。 填充柱价格便宜 ,易得 ,一直占据溶剂残留量检 测的主导地位 ,只是柱效较低 ,只有 500～1000 左 右 ,分离复杂样品的能力差。杨绍英、陈志华在测定 心痛定中两种残留溶剂时就分别用两种色谱条件 , 比较麻烦29。但填充柱仍然是我们的首要选择。张 咏梅、洪铮在紫杉醇原料药中有机溶剂残留量的气 相色谱分析中 ,应用 GDX401 填充柱同时检测甲醇、 乙酸乙酯、二氯甲烷 ,方法准确可靠30。王卫、高立 勤在测定盐酸莫索尼定有机溶剂残留量时以正丙醇 为内标 ,用 GDX - 401 填充柱测定乙醚和异丙醇的 残留量 ,方法灵敏、准确、可信31。邓湘昱也用 GDX - 401 填充柱测定盐酸土霉素中残留甲醇 ,结果证 明方法简单可靠32。黄剑英、顾以振用 GDX - 401 填 充柱、用恒温条件建立同时测定中国药典规定的 7 种溶剂的测定方法 ,方法分离度较好 ,准确可靠33。 这些均说明填充柱在测定残留溶剂中的重要作用。 近年来 ,毛细管柱应用越来越多 ,有取而代之的 趋势。特别是近两年 ,文献报道关于残留溶剂测定 的文章中 ,用毛细管柱测定的约占总数的 90 % ,填 充柱只占 10 % ,由此可见其趋势。 毛细管柱的理论塔板数约为 10 万左右 ,与填充 柱相比柱效和灵敏度均要高的多 ,对复杂和微量残 留溶剂的分析能力有极大的提高 ,所以选择毛细管 柱一般都能解决分离问题。其中柱口直径为 0153mm的大口径毛细管柱因其柱容量大尤其应用 广泛。姚倩、李章万、张强等用几种大口径毛细管 柱 ,以药物合成中常用的 16 种有机溶剂为研究对 象 ,建立检查残留溶剂的方法 ,并考察不同极性的色 谱柱 ( HP - 1 , HP - 5 , HP - 20M) 及不同提取溶剂 (水 ,DMF ,DMSO) 对分离与检测的影响。在雌激素 原料残留溶剂的检测中 ,除甲醇和乙醇外 ,其它 14 种溶剂均在检出限度以下 ,方法简便灵敏 ,准确度 高 ,说明本方法适用于常规药物中溶剂的检查。 另外应用毛细管柱的例子还有很多 ,不胜枚举。 115 　柱温的选择 柱温对分离起关键作用 ,视所测组分和所选用 色谱柱而定 ,一般用固定温度分析 ,即恒温色谱 (IGC) ,柱温范围在 50～200 ℃左右 ,根据样品与残 留溶剂的分离情况而定。对于沸程很宽、残留溶剂 种类较多的样品可选用程序升温的办法 (PTGC) 。 116 　检测器的选择 一般选用 FID 检测器 ,也有选用 MS 为检测器 的 ,多为 GC - MS 联用仪13 ,34。对于含氯元素的溶 剂 ,选用 ECD 检测器专属性强 ,可排除杂质干扰。 中国药典 2000 年版、美国药典 24 版 (USPXXIV)均选 用 FID 检测器 ,英国药典 2000 年版 (BP2000) 则上述 三种检测器均有应用。 2 　比色法 利用残留溶剂中的特殊元素 ,或者残留溶剂特殊 的显色反应 ,用比色法测定其含量。张莉、晁若冰在 有机药物中残留三氟醋酸测定方法的研究中 ,将药物 进行氧瓶燃烧破坏后 ,用苯素氟蓝比色法测定氟 ,再 换算成三氟醋酸的量 ,就是利用三氟醋酸中的氟元素 进行测定 ,结果证明方法简便 ,灵敏 ,结果可靠35。张 21 现代仪器 二 ○○四年·第三期 自霞在测定眼明药液中间体乙醇残留量时 ,利用只有 乙醇能与磷酸铈反应 ,产生琥珀色化合物的原理 ,用 比色法测定其残留量 ,方法灵敏、准确、快速、可靠36。 赵青蓉、余蓉利用硫氰酸钴铵与 Tween - 80 的显色反 应 ,比色法测定 S/ D 法处理中纯因子 VIII 制品中 Tween - 80 的残留量 ,与其它显色法和 HPLC 法相比 , 本方法不受室温影响 ,更简便可靠37。 3 　高效液相色谱法 对于有紫外吸收的溶剂 ,可选用 HPLC 法。王 庆全、黄烈文应用 HPLC 法 ,以甲醇 :水 (75 :25) 为流 动相 ,用 Dopont Zorbax 柱 ,在 254mm 处测定注射用 氨苄青霉素钠中有机溶剂 N ,N - 二甲基苯胺的残留 量 ,结果准确可靠38。应奇才、俞永进等在测定盐酸 氯洁霉素中丙酮含量时 ,以甲醇 :pH410 磷酸二氢纳 (1 : 4) 为流动相 ,丙酮在流动相中为最大吸收的 265mm处 ,测定丙酮的残留量39。 4 　多种方法联合应用 对于比较特殊的样品 ,可以选择两种或两种以 上方法测定 ,进而计算残留量 ,或者相互对照 ,比较 方法之间的准确性。石艳萍在测定对甲苯磺酸中残 留酸时 ,先用紫外法测定对甲苯磺酸的含量 ,然后用 标准碱滴定液测定酸度 ,将两者结果相减 ,即为残留 游离酸的含量 ,方法专属性强 ,可靠 ,很好的解决样 品中游离酸残留量的检测问题40。 应奇才、俞永进等在测定盐酸氯洁霉素中丙酮 含量时 ,用 HPLC 法分别与核磁共振法及热重法相 比较 ,结果证明方法之间差别不大 ,HPLC 法测定结 果更加准确可靠39。 在本项试验中 ,还提出用 NMR 和 TGA 两种方 法应用于测定残留丙酮含量的问题 ,虽然结果不够 准确 ,只是推算出来的 ,但是毕竟是残留溶剂的测定 方法多样性的有益尝试 ,提供新的思路。 　　总之 ,药品中溶剂残留的测定方法多种多样 ,在 实际工作中灵活应用 ,根据药品的具体特点制定专 属性强、灵敏度高、简便、可靠的方法 ,为进一步提高 新药的质量提供有力的保障。 参考文献 1 　李眉 1 简介 ICH 关于药品中溶剂残留量的指导原则 ,中 国药师 ,1998 ,1(3) :119～120 2 　中国药典 　1995 年版 3 　中国药典 　2000 年版 4 　冯晓明 ,马家贞 1 甲硝唑环氧乙烷残留量的检测 ,中国现 代应用药学 ,1999 ,16(5) :39～41 5 　郭国岭 ,姜春刚 1 气相色谱法测定头孢哌酮粉针剂中溶 媒残留量 ,中国药科大学学报 ,1998 ,29(2) :112～114 6 　李月微 ,霍燕兰 1 用顶空气相色谱法测定西伐他汀中甲 苯残留量 ,分析测试学报 ,1999 ,18(1) :44～45 7 　翟莉 ,黄安模 1 顶空色谱法测定磷酯微球中二氯甲烷残 留量 ,中国卫生检验杂志 ,2000 ,10(1) :55～56 8 　王伟 ,韩光智 1 顶空法测定伊索拉啶中乙醇的残留量 ,山 东医药工业 ,1994 ,13(4) :14～14 ,13 9 　狄平平 1 气相色谱法分析盐酸氟西汀中异丙醇残留量 , 药物分析杂志 ,1995 ,15(5) :46～47 10 　殷霞 1 顶空气相色谱法测定氟他米特中的残留苯 ,中国 药科大学学报 ,1993 ,8(1) :22～24 11 　蒋海松 ,关大卫 1 壬苯醇醚中二恶烷的限量检查方法 , 中国医药工业杂志 ,2000 ,31(9) :413～414 12 　何培孝 ,樊庆银 1 壬苯醇醚中二氧六环的限量检查方 法 ,黑龙江医药 ,2000 ,13(4) :210～211 13 　蔡春儿 ,关景华 1 硬膏剂中甲苯残留的吹扫 - 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