仔猪黄白痢

null仔猪黄白痢ST1-LTB双价基因工程苗的研究及应用 仔猪黄白痢ST1-LTB双价基因工程苗的研究及应用 李尚波 高级兽医师 辽宁省益康生物制品厂 辽阳 111000前 言 仔猪黄痢和病原性白痢是由产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）引起的一种肠道传染病。仔猪大肠杆菌病常现为初生仔猪黄痢、2-4周龄仔猪白痢、断乳前后仔猪水肿病和断奶后肠炎四种病型。近年来，随着养猪业的不断发展，仔猪黄白痢的流行越来越广泛，给养猪业造成巨大经济损失。由于耐药菌株的不断增多，使得化药治疗效果越来越不确定和无效；多种血清型菌株的存在，也给免疫预防增添了很大的困难。目前应用的几种疫苗都不具有良好的广谱性，研制出广谱性强的疫苗已成为养猪业迫切的要求。前 言流行病学调查流行病学调查仔猪黄痢：该病以生后12h到5日龄内哺乳仔猪发病最多，一般生后12h内表现正常，此后开始排黄色或淡黄色稀便，常在18h内由于脱水而死亡。据统计，1-3日龄发病的占窝数90.3%；5日内以上发病的仅占6.3%；7日龄以上仔猪很少发病。同窝仔猪发病率高达90%以上，病死亡很高 流行病学调查流行病学调查仔猪白痢：该病一般发生于10-30日龄的仔猪，但以10-20日龄最多见，病势也较严重，一月龄以上的仔猪很少发生。各窝仔猪发病的头数不一，症状不一，发病率高，死亡率低。引起本病的诱因很多，饲料管理、天气变化、奶汁过稠等都可引起仔猪白痢，由ETEC引起的仅占50%左右。 发病机理 发病机理 仔猪黄痢发病机理：本病是由产肠毒素血清型大肠杆菌引起。病菌常随仔猪吃奶和舐母猪皮肤时进入肠道。如果母猪初乳中缺乏对该病原菌的特异性抗体，病原菌即可在仔猪小肠粘膜上皮定殖，产生毒素，这种毒素刺激肠粘膜上皮细胞分泌大量液体，同时抑制绒毛上皮细胞的吸收作用而引起剧烈水泻，导致脱水和代谢性酸硷平衡紊乱，最后虚脱死亡 。发病机理 发病机理 仔猪白痢发病机理：一方面是肠毒素所引起的分泌性腹泻，另一方面还有因炎症促进液体从肠壁向肠腔渗出，以及肠蠕动增强导致肠物，通过肠管加快。在这些条件下，食糜中的大量脂肪被向后推移，与大肠腔内的碱性离子（钙、镁、钠、钾）结合，成为灰白色的脂肪酸皂化物而使粪便变成灰白色，因此在临床上即表现为白痢。 致病因素 致病因素 肠毒素：有两种即不耐热性肠毒素（Heat-labile，toxin，LT）和耐热性肠毒素（Heat-stable，toxin，ST）。LT与小肠粘膜上皮细胞膜表现的GM1受体结合（鸟嘌呤核苷），激活了腺苷酸环化酶，使细胞浆中的CAMP水平增高（3'-5'环化腺苷酸磷酸）引起肠道分泌增加，使大量液体积聚于回肠中，超出肠道再吸收能力，以致出现腹泻症状。ST也能使液体积聚回肠中，能在空、回肠部分改变液体的运转，使肠壁细胞中的电解质向肠腔内释放。 致病因素 致病因素 侵袭力：大肠杆菌具有K抗原和菌毛，菌毛能帮助细菌粘附于肠粘膜表面，使产肠毒素性大肠杆菌发挥致病作用，通常将位于菌毛表面的这种抗原称为定居因子或粘附素，如果产肠毒素性大肠杆菌失去合成菌毛的能力，该抗原即丧失，则不能引起腹泻。现已肯定的定居因子有K88、K99、987P 和F41、F42等。 综上所述，产肠毒素性大肠杆菌（ETEC）不进入肠上皮细胞而是只吸附在肠粘膜现面进行繁殖，并产生肠毒素，引起小肠分泌液体，导致腹泻，也就是说，ETEC的定居因子有K88、K99、987P 和F41、F42等和肠毒素是引起新生仔猪腹泻的关键因素。 防制方面 防制方面 目前应用的疫苗种类 ⑴K88、K99、987P三价全菌灭活苗；⑵K88-K99双价基因工程苗；⑶K88、LTB双价基因工程苗；⑷ST1-LTB双价基因工程灭活疫苗。 上述疫苗特点 ⑴由于ETEC血清繁多，不同血清型产生的抗体交叉免疫力很弱，K88产生的抗体对K99、987P、F41等粘着因子的ETEC影响不大或不起抑制或杀灭作用。因此K88、K99、987P三价全菌灭活苗，K88-K99双价基因工程苗，K88-LTB双价基因工程苗不具有良好的广谱性。 防制方面 防制方面 ST1-LTB双价基因工程苗特点 本疫苗是由辽宁省益康生物制品厂研究开发而成。它针对ETEC共同抗原ST1和LTB，利用基因工程技术，把表达ST1和LTB的目的基因连接起来，插入载体，转化到适宜的受体菌中，成功地构建基因工程菌株BL21（DE3）（PXETSLT1），进行融合蛋白的高效表达。该菌株表达的融合蛋白不仅具有ST1、LTB两种抗原，同时还增强了ST1的免疫原性，而且由于在构建过程中，ST1的一个碱基发生突变，丧失了生物毒性，使本疫苗更加安全有效，其免疫机理是：产生的抗体既有抗ETEC的作用，又有中和LT和ST的毒性作用。经查新检索证实和专家鉴定：本研究已经达到了国际先进水平。 实验室产品检验 实验室产品检验 实验室产品安全检验 选取妊娠母猪6头，分成3组，分别用9801批、9802批、9803批实验室产品于产前20天肌肉注射10ml，观察它们的精神状态和局部病理变化；选取7日龄仔猪3窝，分别用9801批、9802批、9803批实验室产品肌肉注射4ml，观察它们的精神状态、生长发育和局部病理变化。结果实验室产品对妊娠母猪和7日龄仔猪都很安全，无毒副作用。实验室产品检验 实验室产品检验 实验室产品仔猪被动免疫预防黄白痢效力检验 选取妊娠母猪6头，分成3组，分别用9801批、9802批、9803批实验室产品于产前40d和20d各肌肉注射5ml，仔猪出生4h后，对吮食初乳和人工哺乳两组分别口服攻击C83902强毒株1MLD（200亿CFU），连续观察30d，观察死亡及生长情况。结果见表1 实验室产品检验 实验室产品检验 结果表明:疫苗对仔猪被动免疫预防黄痢的保护率为87.5%以上 实验室产品检验 实验室产品检验 实验室产品仔猪加强主动免疫预防白痢效力检验 选取妊娠母猪6头，分成3组，分别用9801批、9802批、9803批实验室产品于产前40d和20d各肌肉注射5ml，仔猪出生吮食初乳4h后口服攻击C83902强毒株1MLD（200亿CFU），每窝取出3~4头作为对照（不免疫），连续观察30d，观察发病及生长情况。结果见表2。实验室产品检验 实验室产品检验 结果表明:本疫苗对仔猪加强主动免疫预防白痢的保护率为100%。 实验室产品田间试验结果 实验室产品田间试验结果 实验室产品田间试验结果 应用9801、9802、9803批实验室产品在辽阳市种猪场进行田间试验，该猪场很久以来一直应用上海的K88-K99双价基因工程苗，据统计平均每20窝仔猪有一窝发生黄痢，因为该猪场饲养管理科学严格，所以白痢很少发生。但是97年秋季以后，黄、白痢发病率迅速上升，后经K抗鉴定血清型为987P。98年7-9月份开始应用我厂的ST1-LTB双价基因工程苗，共免疫妊娠母猪43头，分别于产前30-40天、15-20天各肌肉注射5ml。经观察统计，43头妊娠母猪共产活仔433头，有两窝发生黄痢，发病19头，死亡4头，没有白痢发生。平均每21.5窝仔猪有一窝发病，发病率为4.4%，死亡率为0.9%。总保护率为95.6%。结果见表3。实验室产品田间试验结果 （由于表过于大请参照资料）实验室产品田间试验结果 （由于表过于大请参照资料）基因工程灭活苗对猪的初步应用试验 基因工程灭活苗对猪的初步应用试验 将试生产动物大肠杆菌ST1—LTB双价基因工程灭活苗9801、9802、9803、9804、9805批分别在本厂动物饲养场、沈阳、鞍山、锦州、铁岭、抚顺、大连、黑山、阜新、大石桥和海城等地进行本动物初步应用试验，结果证明（见应用证明）本疫苗安全、无毒副作用；共免疫妊娠母猪5585头，产仔猪62063头，7日龄加强免疫2ml，因黄白痢发病1952头，发病率为3.1%，平均下降39.64%，死亡81，病死率为4.2%，平均下降23.7%，总保护率达96.9%，防制效果非常理想。 仔猪黄白痢ST1—LTB双价基因工程灭活苗产品使用说明书 仔猪黄白痢ST1—LTB双价基因工程灭活苗产品使用说明书 【简介】本品系由基因工程技术人工构建成功的大肠埃希氏菌重组菌株，经培养后产生ST1—LTB双价肠毒素抗原，经甲醛溶液灭活后，加氢氧化铝胶制成。 【物理性状】本品静置后分层，上层为棕黄色澄明液体，下层为灰白色沉淀，振摇后呈均匀混浊液。 【作用与用途】预防仔猪大肠埃希氏菌腹泻(仔猪黄痢和病原性白痢)，用于妊娠母猪和初生仔猪。 【用法与用量】未经本疫苗免疫过的初产母猪，于产前30~40天和15~20天，各注射1次，每次肌肉注射5ml；经过本疫苗免疫过的经产母猪，于产前15~20天肌肉注射5ml；仔猪于产后7日龄肌肉注射2ml。 仔猪黄白痢ST1—LTB双价基因工程灭活苗产品使用说明书 仔猪黄白痢ST1—LTB双价基因工程灭活苗产品使用说明书 【注意事项】 1 妊娠母猪要健康。凡体质瘦弱、体温和食欲不正常的母猪，不宜注射本疫苗。 2 为确保免疫保护效果，应使初生仔猪吃足初乳。 3 凡疫苗瓶破裂、瓶塞松动脱落及内含异物者，严禁使用。 4 疫苗恢复至室温，摇匀后使用。 5 切忌冻存。 【贮藏】在2~8℃保存，有效期为1年。 【规格】5ml、10ml/瓶。