基因芯片论文：基因芯片技术在脑损伤研究中的应用

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Proc Natl Acad Sci U S A，1996，93（12）：5705-5708. 基因芯片技术在脑损伤研究中的应用 Application of gene chip in study of brain injury 舒清明 1,2，倪美兰 3　综述　张永亮 4　审校 1 军医进修学院，北京　100853 ；2 武警总医院 病理科，北京　100039 ；3 武警总医院 门诊部，北京　 100039 ；4 武警医学院 科研部，天津　300162 摘要 ：基因芯片技术是最近发展起来的新兴分子生物学技术，它的并行处理特点使大规模研究脑损伤后的基因改变成为切 实可能。本文综述了新近用基因芯片技术在脑损伤后基因达时序性改变及基因表达谱等研究中的应用。 关键词 ：基因芯片 ；脑损伤 ；基因表达 中图分类号 ：R 651.1　　文献标识码 ：A　　文章编号 ：1005-1139(2010)12-1261-03 颅脑损伤是较常见的死因之一。越来越多的研究表明， 脑损伤可引起多种基因在中枢神经系统表达改变，且在一 些特定基因的表达之间存在内在的调控关系，这些基因参 与了中枢神经系统对各种损伤因素的应答，在脑损伤的病 理生理过程中发挥重要作用，现已知约有 2 万种蛋白质基 因在脑内特异性表达。研究颅脑损伤基因的变化不仅为研 究脑损伤的发生机制及修复再生过程提供了新，也有 助于从分子水平阐明内源性损害或脑保护因子表达的调控 和作用机制，为脑损伤的治疗开辟新途径。基因芯片又称 DNA 探针微阵列 (DNA Probe Microarray)，主要包括四个步 骤：芯片制备、样品制备、杂交反应及信号检测和结果分析。 基因表达谱芯片上固定的既可是 cDNA 片段，又可是寡核 苷酸片段。它可以分析两种或两种以上不同细胞或组织来 源的 mRNA 转录丰度的差异，通过计算杂交信号的比值和 统计分析，可以获得差异基因表达的信息，同时还可以用 聚类分析算法研究在功能或表达调控上具有相关性的基因， 最终为研究基因功能和基因遗传网络提供有力手段。基因 芯片能够在同一时间内分析大量的基因，实现生物基因信 收稿日期 ：2010-04-12　　　　　修回日期 ：2010-05-05 基金项目 ：国家自然科学基金项目 (30471934) Supported by the National Natural Science Foundation of China(30471934) 作者简介 ：舒清明，军医进修学院在读博士，主治医师。Email: shuqingming_hk@yahoo.com.cn。 通信作者 ：张永亮，教授，博导。Email: zyongliang@yahoo.com.cn ·1262· J Chinese PLA Postgrad Med Sch 2010 Dec，31（12）军 医 进 修 学 院 学 报 息的大规模检测，广泛地应用于医学研究的各个领域 [1-4]。 1 脑损伤分子生物学研究成果 近年来国内外研究者采用 RT-PCR、分子原位杂交、 免疫组织化学等技术对脑损伤机理进行了探讨，脑损伤的 发生和发展与许多基因相关，如即刻早期基因 (Immediate Early Gene，IEG) 等 [5-7]，在伤后几分钟有些基因的改变就 可发生并持续升高数日。根据功能 IEG 可分为五大类：1) 调 节神经营养的因子如 NGF、BDNF 等；2) 与炎症有关的基因 如 IL-β，TNF-α 等；3) 与细胞死亡或凋亡有关的基因如 c-myc，c-jun 等；4) 阻断细胞死亡的基因如 bcl-2，p53 等； 5) 与神经元重塑有关的基因如 NCAM，IL-1，NGF 等。上 述研究成果阐明了部分脑损伤的分子机制，但传统的分子 生物学技术只能检测有限的一个或几个基因表达，不能同 时对大量基因进行平行比较。 2 基因芯片技术在脑损伤后基因表达时序性改变研究中 的应用 基因芯片技术的进步不仅为脑损伤的研究提供了新方 法，也有助于从不同水平阐明内源性脑损害或脑保护因子 的表达调控和作用机制，继而为脑损伤的治疗开辟新途径。 2000 年 Morrison 等 [8] 复制大鼠培养脑片机械性牵张损伤模 型，首次利用 cDNA 芯片技术研究了损伤后 6h、24h 和 48h 的基因表达谱变化。芯片含 18 种基因，其中凋亡相关基因 4 种、Ca++ 信号相关基因 3 种、细胞因子类基因 3 种、营养 因子类基因 4 种。涉及凋亡和 Ca++ 信号的基因在 6h 和 24h 表达降低，48h 均恢复到正常水平；而 NGF 在 6h 和 24h 表达 升高，48h 与对照组相同。其他基因未检测到改变。作者 认为这些有选择性的联合改变可能提示机械性损伤可触发 大脑主动和直接的反应过程。中枢神经系统的机械性损伤 可引起钙离子平衡的紊乱，从而导致基因表达的改变、细 胞内营养因子信号级联反应的损害和多种通路凋亡机制的 启动。O′Dell 等 [9] 采用含 31 个基因的芯片检测脑损伤大鼠 皮层单个凋亡神经元的基因表达变化，结果发现：损伤后 12h，bax、NGF、trkB 和 CREB 表达显著下降，24h 返回基 线水平。脑损伤后基因表达的时间差异是由于 2 个独立又 相互存在的分子级联反应所致还是细胞凋亡过程中的时序 变化还不清楚，但这将有助于对脑损伤机制的探讨。 Matizlevich 等 [10] 用含 8 800 个基因的 cDNA 芯片检测了 大鼠皮层冲击后海马 3h、24h 基因表达的变化，按功能分 类这些基因涉及细胞周期、生长因子、受体、神经肽、膜 蛋白、细胞骨架、信号转导等 12 大类。结果发现损伤后 海马有 524 个基因表达改变，损伤后 3h 编码生长因子、葡 萄糖和活性氧代谢、炎性反应的基因上调，其中部分基因 24h 返回到正常水平。这些改变可能有助于揭示损伤后神 经元的存活机制。损伤后 24h 检测到编码细胞膜和细胞骨 架蛋白的基因表达发生改变，同时兴奋性神经递质受体和 参与 Ca++ 信号分子的 mRNA 水平下调，提示与减小损伤引 起的细胞毒性作用和启动修复、组织再生等有关。 Long 等 [11] 采用 cDNA 芯片技术研究了脑损伤后 4h 和 24h 海马基因表达谱的变化，该芯片包含 6 400 个基因。结 果有 253 个基因显示了表达差异，106 个上调，147 个下降， 其中涉及细胞自身稳定的基因和 Ca++ 信号的基因主要上调， 而编码线粒体酶、代谢分子、结构蛋白的基因主要下调， 炎性反应蛋白相关基因表达也有改变。研究发现脑损伤可 引起大量参与线粒体功能和代谢的基因显著下调。作者选 择表达明显且与损伤关系密切的 10 个基因进行 RT-PCR 检 测，发现与芯片检测结果有很好的相关性。其中 NADH 脱 氢酶在 4h 表达无明显改变，而在 24h 显著降低。在呼吸 链中 NADH 脱氢酶可催化 NADH 脱下电子传给泛醌。由于 NADH 脱氢酶的减少可导致 ATP 合成的暂时抑制。因此芯 片检测到 NADH 脱氢酶的 mRNA 水平降低，可能反映有氧 呼吸被抑制，表明大脑对外伤的应答是一个主动的过程。 Li 等 [12] 建立了中度和重度的大鼠脑损伤模型，在伤后 0.5h， 4h 和 24h，用基因芯片检测伤侧海马，发现有大约 10% 的 基因表达改变，且中度伤大鼠海马差异表达基因数目随受 伤时间增加而增加，而重度伤者在相同受伤时间段内，其 差异表达基因数目却是减少的，这可能提示了脑损伤后诱 发的病理生理的瀑布效应伴随着复杂的分子效应，且有一 个时间上的分子窗，正好为基因治疗提供了机会。 Kobori 等 [13] 建立小鼠脑皮层冲击伤模型，在伤后 2h， 6h，24h，3d，14d，用 cDNA 微阵列动态检测，发现受伤 皮层有 86 个已知名的基因和 24 个表达序列标签表达明显变 化，分属 7 个功能类，包括转录因子、信号转导基因和炎 症蛋白等。并讨论了它们对脑损伤后轴突生长、神经元再 生和可塑性的功能意义，提示这些基因有可能成为脑损伤 基因治疗的靶基因。Raghavendra 等 [14] 采用基因芯片和 PCR 技术进行了大鼠皮层冲击后皮层 24h 基因表达情况的研究， 也有类似发现。最近 Lei 等 [15] 采用基因芯片和实时定量 PCR 技术检测了脑损伤后大鼠皮层 6h，24h，48h 和 72h 基因表 达的情况，而且每个时间点表达上调和下调的基因都不同。 3 脑损伤后基因表达谱分析 基因的表达分析是基因芯片最重要的用途之一，寻找 和鉴定疾病相关基因是分子水平上研究疾病、揭示发病机 制的一项重要基础性研究。Matizlevich 等 [10，16] 复制可控制 皮层冲击模型，用含 8 800 个基因的 cDNA 芯片比较了额叶 皮层和海马在正常和损伤后的基因表达谱。按功能分类这 些基因涉及细胞周期、生长因子、受体、神经肽、膜蛋白、 细胞骨架、信号转导等 12 大类。结果显示正常时额叶皮层 和海马有 65 个基因表达有差异，其中 35 个在海马高表达， 30 个在额叶皮层高表达。脑损伤 24h 后海马有 241 个基因 的 mNRA 水平改变，而额叶皮层有 341 个基因的表达改变。 在这 582 个基因中，52 个基因在两个部位的改变是同向的， 而在正常情况下高表达的 65 个基因在损伤后只有 10 个基 因表达发生改变。与正常相比，脑损伤可诱导海马和额叶 的基因表达谱改变，同时二者的表达谱也不同。以往研究 表明海马对中枢神经系统的损伤尤其敏感，而额部皮层有 相对高的再生和可塑能力。Ying 等 [17] 完全横切大鼠海马贯 穿通路，35d 后处死、分离海马，选用含有 8 000 个基因的 cDNA 芯片检测其基因表达谱，发现有 47 个基因表达差异 ·1263·J Chinese PLA Postgrad Med Sch军 医 进 修 学 院 学 报 2010 Dec，31（12） 在 3 倍以上，包括 39 个已知基因及 8 个已表达序列标志或 新基因。这些基因大多属于编码大分子蛋白质合成及修饰 的基因，包括转录因子、翻译调节酶、与 DNA、RNA 及蛋 白质修饰有关的酶等。另一类属于编码与损伤相关蛋白的 基因，如炎性反应蛋白基因表达增高，而维持体内离子平 衡的蛋白质基因表达水平下降。无论基因上调还是下调， 提示损伤诱导海马积极地启动自身修复机制，调节内环境、 合成蛋白质、调节轴突的生长和重塑等。 不同种系和不同损伤模型的基因表达谱将有助于脑损 伤机制的探讨。最近 Natale 等 [18] 用高密度基因芯片比较了 大鼠中度侧位液压脑损伤和小鼠侧位皮质打击伤模型在损 伤后 4h、8h、24h 和 72h 的基因表达谱。结果在两个种系都 显著改变的基因有 82 个，涉及 12 类如炎性反应 (17%)、转 录调节 (16%)、细胞黏附 / 细胞外基质 (15%) 等。在两个模 型中相同改变的基因有 50% 以往没有报道过，其中包括与 神经元变性和神经保护相关基因。 在 哺 乳 动 物 中 神 经 干 细 胞 位 于 脑 室 下 区 (Sub- Ventricular Zone，SVZ) 和齿状回 (Dentate Gyrus，DG)，可产 生新的神经元。然而研究发现，脑损伤后双侧 SVZ 和 DG 的 细胞显著增加了，但是这些增生的细胞没有引起损伤区域 产生有效的再生反应。为探索其分子机制，Yoshiya 等 [19] 用 cDNA 芯片 ( 含 9 596 个基因 ) 检测了脑损伤后 SVZ 的基因表 达情况。结果发现 97 个基因表达上调而 204 个下调。对这 些表达发生改变的基因进行功能分类，提示脑损伤广泛影 响细胞的功能。 Marcino 等 [20] 用 8 000 点的基因芯片对脑损伤后海马 神经元的基因表达谱进行了观察，提示创伤后海马区发生 凋亡的神经元细胞和对照细胞的基因表达存在显著差异。 Harrison 等报道：他们采用 18 000 点的 cDNA 芯片，对小鼠 大脑皮层撞击伤后3h-7d撞击同侧和对侧大脑半球的基因表 达谱进行了比较，发现它们之间存在显著的差异。从基因组 表达水平对脑损伤后发生细胞凋亡的分子机制进行了研究。 Von 等 [21] 发现皮层冲击伤后 1d 和伤后 4d 的基因表达 谱不同，而且重叠的基因很少，显示时间依赖性。损伤病 理机制调节基因知识的增加将有助于找到未来治疗的目标。 由于创伤是神经退行性疾病的危险因素，丰富这方面的知 识也可减少后期的负面影响。 参考文献 1 李芸，余秉翔 . 基因芯片技术在肺癌研究中的应用［J］. 军医 进修学院学报，2010，31（4）：401-403. 2 刘运来，蔡文琴 . 基因芯片技术在神经系统研究中的应用［J］. 解剖科学进展，2004，10（4）：326-331. 3 杨义强，王春艳 . 基因芯片技术在药学研究中的应用［J］. 齐 鲁药事，2009，28（5）：293-295. 4 张仲林，彭成 . 基因芯片技术在中医药研究领域中的应用［J］. 中国药科大学学报，2007，38（2）：190-192. 5 Raivich G，Bohatschek M，Kloss CU，et al. 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