取卵后第3天胚胎形态学指标与移植后着床的关系

文章编号 :1003 - 6946(2007) 02 - 106 - 03 取卵后第 3 天胚胎形态学指标与移植后着床的 关系Ξ 陈士岭 ,李 　劲 ,孙 　玲 ,邢福祺 (南方医科大学南方医院妇产科生殖医学中心 ,广东 广州 510515) 【摘要】　目的 :探讨取卵后第 3 天 (Day3) 多个胚胎形态学指标与胚胎着床的关系。方法 :选取 年龄 ≤35 岁 ,进行 Day3 胚胎移植患者 ,按胚胎移植后全部植入或未植入分为 ,植入组 :30 个移植 周期 ,56 个胚胎 ;未植入组 :32 个移植周期 ,64 个胚胎。分析 Day3 胚胎卵裂球数目、大小差异、卵 裂球核、卵裂球颜色及颗粒、碎片比例和类型、胞质内空泡等与胚胎种植之间的相关性。结果 : Day3 胚胎发育速度、卵裂球核数量和碎片类型在两组间差异有显著性 ( P < 0. 05) 。植入组中 7～ 8 细胞组最多见 (71. 4 %) ,尤其是 8 细胞高达 60. 7 %。卵裂球核指标中 ,植入组至少一单核组最 多见 (57. 1 %) 。碎片类型中植入组 T1 出现率最高 ,为 41. 1 %。其他形态学指标在两组间无统计 学差异 ( P > 0. 05) 。判别分析明卵裂球数和碎片类型较卵裂球核、卵裂球大小差异、碎片多少 对胚胎植入判别符合率为 70. 0 %。结论 :在选择移植胚胎时 ,胚胎生长速度及碎片类型是考虑 的首要因素 ,其次是胚胎碎片含量。 【关键词】　人早期胚胎 ;胚胎形态 ;体外受精2胚胎移植 ;胚胎着床 中图分类号 :R715. 2 　　　　文献标识码 :A Relatio ns hip betwee n Em bryo Morp h olo gy o n Day3 of Develop me nt afte r O ocyte Retrieval a n d Em bryo Impla ntatio n CHEN Shiling ,LI Jin ,SUN Ling ,et al (Center for Reproductive Medicine ,Department of Obstetrics and Gynecology ,Nanfang Ho spital ,Nanfang Medical University , Guangzhou Guangdong 510515 ,China) 【Abs tract】　O bjective : To investigate the relationship between embryo s morphology on day3 of development and implantation rate s of embryo .Met hods :62 cycle s of in vitro fertilization and embryo transfer (IVF2ET) of < 35 years women were cla ssified into two group s :implantation group (implantation rate was 100 % ,30 cycle s/ 56 embryo s) and un2implantation group (implantation rate was 0 % ,32 cycle s/ 64 embryo s) . All morphologic characteristic of embryo on day3 of development were analyzed including bla stomere quantity , size ,nucleus ,color ,granulation ,the ratio and type of fragments ,granular area vacuole s ,the thickness and shape of zona pellucida .Res ults :A statistical difference was observed in the rate of embryo development ,bla stomere nuclei quantity and the type of fragmentation between the two group s ( P < 0. 05) . In implantation group ,71. 4 % (40/ 56) transferred embryo s showed 7～8 cells on day3 57. 1 % ,bla stomeres showed at lea st one visible nucleus ,30. 4 % embryo s have one nucleus in each bla stomere , 41. 1 % embryo s showed fragmentation of T1 pattern. The discriminant analysis indicated that the number of bla s2 tomere s and fragmentation pattern were more important than the nucleus and size of bla stomeres ,fragmentation number. And the discriminant accordance rate of embryo implantation was 70. 0 %.Conclusions : The rate of bla s2 tomere development and fragmentation type are principal factor for selecting embryo transferred and 82cell and 72cell on the day3 after oocyte retrieval had better implantation potential. It should pay more attention to the fragmentation type than fragmentation quantity. 【Key w ords】　Human early embryo ; Embryo morphology ;In vitro fertilization2embryo transfer ; Embryo implantation 　　应用体外受精2胚胎移植 ( IVF2ET) 治疗不孕症获 得妊娠涉及多方面因素 ,其中胚胎质量为重要因素之 ·601· 实用妇产科杂志 2007 年 2 月第 23 卷第 2 期　Journal of Practical Obstetrics and Gynecology 2007 Feb. Vol . 23 , No. 2 Ξ 基金项目 :国家自然科学基金 (编号 :30470657) 、广东省自然科学基金 (编号 :04020416) 李劲现在工作单位 :中国人民解放军第 187 医院 ,海南 海口 571159 © 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 一。对于早期胚胎质量与妊娠结局的关系 ,国外已有 很多报道 ,但多数为取卵后 48 小时 (Day2) 形态。Day3 的人胚胎有其重要形态学特征 ,为此本研究着重探讨 Day3 胚胎发育速度、卵裂球大小差异、卵裂球核、胚胎 中碎片多少及碎片类型、卵裂球颜色及颗粒、卵裂球内 空泡、透明带厚度及形状与 Day3 移植后着床的关系。 1 　材料和方法 111 　研究对象 　前瞻性分析 2004 年 10 月至 2005 年 1 月 ,在南方医院生殖医学中心接受 IVF2ET 治疗的不 孕症患者中 ,选取满足下列条件患者 :年龄 ≤35 岁 ,注 射人绒毛膜促性腺激素 ( HCG) 日子宫内膜厚度 ≥8 mm ,Day3 进行胚胎移植。按照移植胚胎全部着床或全 部未着床分为 ,植入组 :30 个移植周期 ,共计移植 56 个胚胎全部着床获得临床妊娠 ;非植入组 :32 个移植 周期 ,共计移植 64 个胚胎均未着床 ,未获得临床妊娠。 112 　实验方法 11211 　卵子的获得 　采用黄体期促性腺激素释放激 素激动剂 ( GnRH2a)长 ,达到降调节后给予卵泡刺 激素 (FSH)和 (或)人绝经期促性腺激素 ( HMG) 行超促 排卵 ,根据患者年龄、基础卵泡数等适当增减。阴道 B 超监测卵泡发育 ,当有 3 个卵泡直径 > 16～17 mm 时 给予 HCG 5000～10000 U 肌内注射 ,36 小时后行 B 超 引导下经阴道取卵术。 11212 　精子收集、处理和受精 　取卵当天上午患者丈 夫取精 ,采用精子分离液密度梯度离心方法处理 ,根据 精子情况决定行常规体外受精或胞浆内单精子注射。 11213 　胚胎培养及形态观察 　胚胎置于 5 % CO2 , 37 ℃培养箱内培养 ,用 Quinn AdvantageTM序贯培养基 , 采用微滴法培养。受精后 16～20 小时在 TE300 型倒 置显微镜下观察原核期形态 ,胞质中出现 2 个原核 (2PN)的受精卵定义为正常受精卵 ,受精后 64～66 小 时观察每个胚胎 Day3 各形态指标。 11214 　胚胎移植和临床妊娠检查 　Day3 上午进行胚 胎移植。选择移植胚胎标准 :2PN 发育而来的良好胚 胎 (将卵裂球数目 ≥6 个 ,碎片 ≤20 % ,卵裂球无明显 大小差异的胚胎定义为良好胚胎) ;若无良好胚胎 ,也 尽量选取卵裂球数多、碎片少、卵裂球大小差异不明显 胚胎。胚胎移植 4 周后 ,B 超检查见胎心搏动为临床 妊娠。 113 　Day3 胚胎实验分组 11311 　胚胎发育速度参考 Alikani[1 ]标准分为 5 组 : ≤ 4 细胞组 ;5～6 细胞组 ; 7～8 细胞组 ; 9～10 细胞组 ; Compact 组 (胚胎紧密化 ,即卵裂球间界限不清 ,相互粘 附) 。 11312 　卵裂球核形态参考 Moriwaki[2 ]标准分为 5 组 : 无可见卵裂球核组 ;均一单核组 ,即每一个卵裂球内均 含有一个单核 ;至少一个单核 ,无多核组 ;含多核比例 ≤25 %组 ;含多核比例 > 25 %组。 11313 　根据卵裂球大小是否一致分 2 组 :无差异组 ; 有差异组。 11314 　胚胎碎片量根据碎片占胚胎的比例分 3 组 : 0 %～ ≤5 %组 ;6 %～20 %组 ; > 20 %组。 11315 　碎片类型参考 Alikani[1 ]标准分为 5 组 :T0 无碎 片 ;T1 局限于 1 卵裂球周围 ; T2 局限于卵周隙内 ; T3 小、散在分布 ; T4 碎片大 ,散在分布 ,与卵裂球不易区 分。 11316 　卵裂球颜色分 2 组 :正常组 ;异常组 (包括卵裂 球发黑、发黄) 。 11317 　卵裂球颗粒分 2 组 :均一颗粒组 ;颗粒增粗组。 11318 　卵裂球内空泡分 2 组 :无 ;有。 11319 　透明带厚度分 2 组 :正常组 ;增厚组。透明带 形状分 2 组 :正常组 ;变形组 (包括分层、变形) 。 114 　统计学分析 　采用χ2 检验 ,判别分析 ,显著水平 取 P < 0105 ,用 SPSS 1210 统计软件包处理。 2 　结 　果 211 　胚胎发育速度在植入组与未植入组之间差异有 显著性 ( P < 0105) 。植入组胚胎中 ,7～8 细胞组最多 见 (7114 % ,40/ 56) ,其中 8 细胞最多见 (6017 % ,34/ 56) ,其次为 Compact 组 (1215 % ,7/ 56) ;9～10 细胞组、 ≤4 细胞组最少见 (316 % ,2/ 56) 。未植入组中上述 4 组的发生率分别为 4513 % ( 29/ 64) , 1215 % ( 8/ 64) , 417 %(3/ 64) ,1411 %(9/ 64) 。 212 　卵裂球核在植入组与未植入组之间差异有显著 性 ( P < 0105 ) 。植入组中至少一单核组最多见 (5711 % ,32/ 56) ,其次为均一单核组 (3014 % ,17/ 56) , 多核 > 25 %组最少见 (118 % ,1/ 56) 。而未植入组中分 别为 3414 % ,1215 % ,1516 %。 213 　卵裂球大小差异在植入组无差异 52 (9219 %) ,有 差异 4 ( 711 %) ; 未植入组分别为 58 ( 9016 %) , 6 (914 %) ,两组比较差异无显著性 (χ2 = 01195 , P = 01659 , P > 0105) 。 214 　胚胎中所含碎片比例为 0 %～5 % ,6 %～20 % , > 20 %在两组中分别为 39 (6916 %) 与 34 (5311 %) ; 14 (2510 %)与 23 (3519 %) ;3 (514 %) 与 7 (1019 %) 。两组 比较差异无显著性 (χ2 = 31614 , P = 01164 , P > 0105) 。 215 　碎片类型在植入组与未植入组之间差异有显著 性 ( P < 0105) 。植入组中 T1 类型最多见 (4111 % ,23/ 56) ,其次分别为无碎片类型 (2618 % ,15/ 56) 和 T2 类 ·701·实用妇产科杂志 2007 年 2 月第 23 卷第 2 期　Journal of Practical Obstetrics and Gynecology 2007 Feb. Vol . 23 , No. 2 ' 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 型 (2312 % ,13/ 56) ,植入组中无 T4 类型出现。未植入 组中分别为 516 % ,2013 % ,2811 % ,613 %。 216 　卵裂球颜色及颗粒、卵裂球内空泡、透明带厚度 及形状在植入组与未植入组之间差异均无显著性 ( P > 0105) ,见表 1。 表 1 　Day3 胚胎其他形态与胚胎种植的关系 Tab 1 Relationship between embryo morphology on day3 of development and implantation of embryo transfer 胚胎其他形态 植入组 n ( %) 未植入组 n ( %) χ 2 P 卵裂球颜色 正常 54(9614) 63(9814) 异常 2 (316) 1(116) 01495 01482 卵裂球颗粒 均一 54(9614) 63(9814) 增粗 2 (316) 1(116) 01495 01482 卵裂球内空泡 无 53(9416) 60(9318) 有 3 (514) 4(613) 01043 01835 透明带厚度 正常 50(8913) 58(9016) 增厚 6 (1017) 6(914) 01060 01807 透明带形状 正常 56(100) 62(9619) 变形 0 2(311) 11780 01182 217 　对卵裂球数、卵裂球核、卵裂球大小差异、碎片多 少及碎片类型 5 个指标预测植入进行判别分析 ,卵裂 球数、碎片类型预测胚胎是否植入差异有显著性 ( P < 0105) 。判别函数为 :植入 = - 01584X1 + 01720X2 ( X1 : 卵裂球数 ,X2 :碎片类型) ,判别符合率为 7010 %。 3 　讨 　论 　　评价 Day 3 胚胎质量的形态学指标涉及多个因 素 ,其中在传统选择移植胚胎标准中 ,胚胎生长速度是 考虑的首位因素。Alikani 等[1 ]发现 Day3 为 7～9 细胞 的胚胎 ,Day5 囊胚形成率为 4119 % ,明显高于 > 9 细胞 (2715 %)或 < 7 细胞 (1318 %) 。本研究中 Day3 胚胎发 育速度明显影响种植率 ( P < 0105) ,植入组中 7～8 细 胞组最多见 (7114 %) ,其中以 8 细胞最多见 (6017 %) , 进一步证实 Day3 胚胎发育至 8 细胞是移植胚胎的最 佳选择。9～10 细胞组、≤4 细胞组最少见 (316 %) ,尤 其 9 细胞移植后均未获得妊娠 ,说明发育缓慢或过快 的胚胎着床能力显著低下 ,并非发育速度越快胚胎发 育潜能越好。 　　Moriwaki 等[2 ]认为单核卵裂球对于妊娠结局有很 好的预测价值 ,而且在高龄妇女胚胎中以多核卵裂球 多见 ,考虑为种植率降低的一个原因。同时作者认为 如果卵裂球核的发展具有明显的阶段性 ,没有卵裂球 核的胚胎应在一定时间间隔进行观察。有报道[3 ]提示 具有多核卵裂球的胚胎染色体异常可能性高。尽管移 植多核卵裂球的胚胎可能会有正常胎儿出生 ,但这种 移植增加了异常的风险。本研究中均一单核胚胎种植 率最高 (6818 %) ,多核 > 25 %组种植率最低 (911 %) , 但本研究中未能对多核卵裂球进行染色体的检查 ,而 且为避免多次观察对胚胎培养的影响 ,对于卵裂球核 的观察仅限于受精后 64～66 小时。 　　卵裂球发育同步时从形态上观察表现为卵裂球大 小一致 ,这是正常胚胎发生和妊娠的重要前提。不整 齐、不规则的卵裂球大小表现出差异性 ,提示可能是胚 胎异常发育或某些培养条件的不适宜 (如 pH 值、渗透 压和温度等剧变) 所引起。本研究中卵裂球大小差异 与妊娠结局无统计学意义 ,可能与本研究中移植胚胎 中卵裂球大小有差异仅占 813 % (10/ 120) 有关 ,其中 4 个为植入组 ,6 个为未植入组。 　　碎片是胚胎体外培养中最常出现的现象 ,产生原 因可能与配子质量、受精时精子密度高、温度或 pH 变 化及卵巢用药方案有关。Alikani 等[1 ]发现胚胎中 > 15 %的碎片囊胚形成率 (1615 %) 明显低于 0 %～15 % 的碎片囊胚形成率 (3313 %) ,而且小、分散的碎片不影 响胚胎的进一步生长 ,含有大碎片的胚胎种植率才明 显降低。本研究中移植胚胎碎片的多少并不影响胚胎 种植 ( P > 0105) ,这可能是由于碎片 > 20 %的移植胚 胎样本量小所造成的。不同碎片类型在胚胎种植率上 差异有显著性 ( P < 0105) , T1 类型胚胎种植率最高 (6917 %) ,T4 碎片类型均未植入 ,同样表明了大而分 散的碎片比较小而局限的碎片对胚胎的发育潜能有更 多负面的影响 ,提示在选择移植胚胎时 ,应更多关注碎 片类型 ,而不是传统所认为的碎片含量多少。 　　综上所述 ,Day 3 卵裂球数、卵裂球核、碎片类型直 接影响胚胎的种植潜能 ,其中胚胎发育速度和碎片类 型是更为重要的指标。本研究发现碎片含量、卵裂球 大小差异、卵裂球颜色及颗粒、卵裂球内空泡、透明带 厚度及形状对胚胎种植无明显影响 ,可能与样本量过 少有关 ,它们与胚胎种植是否有关尚需进一步研究。 综合评价多种形态学指标 ,更为精确地预测胚胎质量 , 指导选择应移植胚胎 ,可提高临床妊娠率和胚胎种植 率。 参 考 文 献 [1 ] 　Alikani M ,Calderon G,Tomkin G,et al . Cleavage anomalies in early hu2 man embryos and survival after prolonged culture in2vitro [J ] . Hum Re2 prod ,2000 ,15 (12) :2634 - 26431 [2 ] 　Moriwaki T , Suganuma N , Hayakawa M , et al . Embryo evaluation by analysing blastomere nuclei [J ] . Hum Reprod ,2004 ,19 (1) :152 - 1561 [3 ] 　Kligman I ,Benadiva C ,Alikani M ,et al . The presence of multinucleated blastomeres in human embryos is correlated with chromosomal abnormalities [J ] . Hum Reprod ,1996 ,11 (9) :1492 - 14981 (收稿日期 :2006208209 ;修回日期 :2006211206) ·801· 实用妇产科杂志 2007 年 2 月第 23 卷第 2 期　Journal of Practical Obstetrics and Gynecology 2007 Feb. Vol . 23 , No. 2 ' 1994-2008 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net