芳酸及其酯类药物的分析

第五章 第六章 芳酸及其酯类药物的 教学目的和要求 了解常用芳酸及其酯类药物品种；从水杨酸类、苯甲酸类药物的结构出发，结合其理化性质，理解鉴别、杂质检查和含量测定所用的意义；掌握我国药典收载的此类药物的鉴别、检查、含量测定方法，了解国外有关药品的相应内容；了解其它芳酸类药物的分析方法。 1.在已学巴比妥类药物的分析之后，让学生理解药物分析的过程。从结构、性质出发，考虑鉴别、检查和含量测定方法，使学生逐渐体会到看结构、想性质、找分析方法的关联。 2．水杨酸类药物详讲，苯甲酸类药物略讲，其它芳酸类药物指出结构，讨论性质，学生自学鉴别、检查和含量测定方法 芳酸及其酯类药物分子结构的共性：既具有苯环，又有羧基，或另有取代基。 本章主要讨论三类药物的分析：（1）水杨酸类；（2）苯甲酸类药物；（羧基直接与苯环相连）；（3）其他芳酸及其酯类药物（羧基为磺酸基或通过烃氧基等与苯环相连者）。 教学重点，难点 重点 1．芳酸及其酯类药物的结构、性质与鉴别、含量测定方法之间的关联。 2．水杨酸类和苯甲酸类药物的含量测定方法。 阿司匹林、苯甲酸的酸碱滴定法 苯甲酸的双相滴定法 难点： 1．对氨基水杨酸钠中间氨基酚限量检查HPLC法的讨论（反相离子对色谱法） 2．柱分配色谱-紫外分光光度法测定阿司匹林中水杨酸的方法及讨论 3．一些药物的IR 第一节 典型药物分类与理化性质 一、水杨酸类药物 （一）典型药物的结构 水杨酸(salicylic acid) 阿斯匹林（aspirin） 对氨基水杨酸钠 (sodium aminosalicylate) 双水杨酯(salsalate) 贝诺酯(benorilate) （二）主要理化性质 均为固体，具有一定的熔点 1.分子结构中具有苯环和特征官能团，均具有紫外和红外特征吸收光谱，已为一些国家药典用于鉴别。 2.溶解行为：成盐者易溶于水（水杨酸二乙胺、对氨基水杨酸钠），其他药物则微溶或几乎不溶于水，而能溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂。 3.酸性：水杨酸类药物的酸性受苯环、羧基和取代基的影响。一般属于中等强度的酸或弱酸。 取代基（卤素、硝基、羟基）---能降低苯环电子云密度，使羧基中羟基氧原子的电子云密度降低，从而增加氧氢键极性，较易离解出质子，故酸性较苯甲酸强。 取代基（甲基、氨基）---能增加苯环电子云密度从而降低氧氢键极性，使酸性较苯甲酸弱。 4.水杨酸：羟基与羧基有邻位效应，能形成分子内氢键，酸性增强，酸性（pKa 2.95）比苯甲酸（pKa 4.26）强得多。阿司匹林为水杨酸乙酰化物，酸性（pKa 3.49）较水杨酸要弱些，但比苯甲酸的酸性强。 5．芳酸酯类药物易水解而分解，如阿司匹林、双水杨酯。 二、苯甲酸类 （一）典型药物的结构 苯甲酸及其钠盐 羟苯乙酯(ehylparoben) 丙磺舒(probenecid) 甲芬那酸(mefenamic acid) （二）主要理化性质 （1）弱酸性：苯甲酸、丙磺舒、甲芬那酸具有弱酸性。 （2）溶解性：除了苯甲酸钠易溶于水外，其它药物在水中微溶或几乎不溶，而苯甲酸、羟苯乙酯易溶于乙醇、乙醚等有机溶剂；丙磺舒、甲芬那酸在乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂中略溶、微溶或难溶，氮均溶于氢氧化钠溶液。 三、其他芳酸类 （一）典型药物的结构 氯贝丁酯（clofibrate） 布洛芬(ibuprofen) （二）主要理化性质 氯贝丁酯、布洛芬在乙醇、乙醚、丙酮、氯仿中易溶，在水中几乎不溶。 小结 典型药物分类与理化性质 1、​ 水杨酸类 1，​ 典型药物 2，​ 理化性质 2、​ 苯甲酸类 1，​ 典型药物 2，​ 理化性质 3、​ 其他芳酸类 第二节 鉴别试验 一、与铁盐的反应 本类药物具有酚羟基或水解后能产生酚羟基，可在中性或弱酸性条件下，与三氯化铁试液反应，生成紫堇色铁配位化合物。 应适宜的pH值为4～6，在强酸性溶液中配位化合物分解。本反应极为灵敏，只需取稀溶液进行试验；如取样量大，产生颜色过深时，可加水稀释后观察。 直接：水杨酸、对氨基水杨酸钠、双水杨酯、水杨酸二乙胺、酚磺乙胺、对乙酰氨基酚 水杨酸 ChP（2000） [鉴别] （1）取本品的水溶液，加三氯化铁试液1滴，即显紫堇色。 间接：阿司匹林、贝诺酯 阿司匹林 ChP（2000） [鉴别] （1）取本品约0.1g，加水10ml，煮沸，放冷，加三氯化铁试液1滴，即显紫堇色。 1．水扬酸及其盐在中性或弱酸性溶液条件下，与三氯化铁反应，生成紫堇色配位化合物。 2．苯甲酸的中性或碱性溶液，与三氯化铁生成碱试苯甲酸铁盐的赭色沉淀。 3．丙磺舒的钠盐在弱酸性介质中与三氯化铁反应，生成米黄色沉淀。 4．布洛芬的无水乙醇溶液，加入高氯酸羟胺-无水乙醇试液，混合后，在温水加热20min。冷却后，加高氯酸铁-无水乙醇溶液，即成紫色。 二、重氮化-偶合反应 分子结构中具有芳伯氨基（对氨基水杨酸钠）或潜在芳伯氨基（贝诺酯）的药物，加酸水解后产生芳伯氨基结构，在酸性与亚硝酸钠试液进行重氮化反应，生成的重氮盐与碱性b－萘酚偶合产生橙红色沉淀。 芳香第一胺类鉴别反应，具芳伯氨基或潜在芳伯氨基的药物 直接：对氨基水杨酸钠、盐酸普鲁卡因、苯佐卡因、盐酸普鲁卡因胺 间接：对乙酰氨基酚（扑热息痛）、醋氨苯砜、贝诺酯 1．​ 贝诺酯具有潜在的芳伯氨基，水解后能发生重氮化-偶合反应。 2．​ 甲芬那酸的甲醇溶液，与对- 硝基苯重氮盐在碱性下偶合产生橙红色。 三、氧化反应 甲芬那酸加硫酸溶解后，与重铬甲酸钾试液反应，即呈深蓝色，随即变为棕 绿色。 酚磺乙胺加硝酸，于水浴上蒸干，可将有机硫分解氧化为硫酸根离子，与氯化钡反应，产生硫酸钡白色沉淀；本品水溶液，加硝酸后不加热，则不能氧化成硫酸，故不与氯化钡产生沉淀。 四、水解反应 阿司匹林与碳酸钠试液加热水解，得水杨酸钠及醋酸钠，加过量稀硫酸酸化后，则析出白色水杨酸沉淀，并发生醋酸的臭气。沉淀物于100～105°C干燥后，熔点为156～161°C。 双水杨酯亦能产生类似的水解反应。 1．​ 阿斯匹林 在碱性试液加热水解，得水杨酸钠和醋酸钠，加过量稀硫酸 酸化后，则生成白色沉淀，并生醋酸的臭气。 2．​ 双水杨酸 在碱性试液加热水解，酸化即生成白色的水杨酸沉淀。 3．​ 氯贝丁酯 其分子结构中具有酯的结构，碱水解后与盐酸羟胺生成异羟 肟酸盐，在弱酸性条件下与三氯化铁呈紫色异羟肟酸铁。 4．​ 羟苯乙酯的乙醇溶液，煮沸后，加硝酸汞实业，放置后逐渐生成沉淀， 上清液呈红色。 五、分解产物反应 1.苯甲酸盐可分解成苯甲酸升华物，可用于鉴别。如苯甲酸钠置干燥试管中，加硫酸后，加热，不炭化，但析出苯甲酸，在试管内壁凝成白色升华物。 2.含硫药物可分解后鉴别，如丙磺舒与氢氧化钠熔融，分解生成亚硫酸钠， 经硝酸氧化成硫酸盐，而显硫酸盐反应。 3.丙磺舒高温加热分解产生二氧化硫气体，有二氧化硫的特殊气味。 4. 酚磺乙胺与NaOH试液加热后，放出二乙胺臭气，可使湿润的红色石蕊试纸变兰色。 六、紫外吸收光谱法 紫外吸收光谱为电子光谱，一般只有2～3个较宽的吸收带，若分子中某些部分的结构略有不同，对紫外吸收光谱却影响不大，因此，紫外吸收光谱用于药物的鉴别，不如红外吸收光谱特征性强，但紫外光谱法所用仪器较为普及，方法比较简便，灵敏度也高，与其他方法配合使用，不失为一种较好的鉴别方法。 1．​ 利用紫外特征吸收法 应用实例见下表： 药物名称 溶 剂 浓度 λmax E1%1cm A 贝诺酯 无水乙醇 240nm 730～760 氯贝丁酯 甲醇 0.001% 226nm 460 甲醇 0.01% 280, 288nm 44, 31 羟苯乙酯 乙醇 5mg/ml 259nm 0.48 丙磺舒 盐酸-乙醇 20mg/ml 280, 249nm 0.67 布洛芬 0.4%NaOH 0.25mg/ml 265, 273nm 甲芬那酸 盐酸-甲醇 20mg/ml 279nm 0.68～0.69 350nm 0.59～0.60 2．利用双波长吸收度比法 （1）对氨基水杨酸钠：10μg/ml, A265/A299为1.50～1.56。 (2) 甲芬那酸：10mg/ml, A278~280/A348~352为1.15～1.30。 七、红外吸收光谱法 水扬酸类药物中的水杨酸、对氨基水杨酸钠和贝诺酯；苯甲酸类药物中的丙磺舒、甲芬那酸及其他芳酸中的氯贝丁酯、布洛芬等均采用此法鉴别。 第三节 特殊杂质检查 一、阿斯匹林中的游离水杨酸的检查 采用比色法进行检查。 1.合成工艺 2. 检查 （1）溶液的澄清度：利用溶解行为的差异，检查碳酸钠试液中不溶物。阿司匹林可溶于碳酸钠试液，而杂质不溶。不溶物杂质：未反应完全的酚类，或水杨酸精制时温度过高，产生脱羧副反应的苯酚，及合成中由副反应生成的醋酸苯酯、水杨酸苯酯和乙酰水杨酸苯酯等。 （2）水杨酸：由生产过程中乙酰化不完全或贮藏过程中水解产生。水杨酸对人体有毒性，而且分子中酚羟基在空气中被逐渐氧化成一系列醌型有色物质，如淡黄、红棕甚至深棕色，使阿司匹林成品变色。 检查原理：利用阿司匹林结构中无酚羟基，不能与高铁盐作用，而水杨酸则可与高铁盐反应生成紫堇色，与一定量水杨酸对照液生成的色泽比较，从而控制游离水杨酸的限量。 检查方法：取本品0.1g，加乙醇1ml溶解后，加冷水适量使成50ml，立即加新制的稀硫酸铁铵溶液[取盐酸溶液（9® 100）1ml，加硫酸铁铵指示液2ml后，再加水适量使成100ml] 1ml，摇匀；30秒钟内如显色，与对照液（精密称取水杨酸0.1g，加水溶解后加冰醋酸1ml，摇匀，再加水使成1000ml，摇匀，精密量取1ml，加乙醇1ml，水48ml，与上述新制的稀硫酸铁铵溶液1ml，摇匀）比较，不得更深。其限量为0.1％。 由于阿司匹林在制剂过程中又易水解为水杨酸，因此药典规定阿司匹林片剂和肠溶片均按上述类似方法控制杂质水杨酸的限量，限量分别为：0.3％和1.5％；阿司匹林栓（HPLC法）水杨酸限量：1.0％。 （3）易炭化物：检查被硫酸炭化呈色的低分子有机杂质。 二、对氨基苯甲酸中间氨基酚检查 Ch p采用双向滴定法进行检查；USP采用HPLC法进行检查。 1.间氨基酚杂质的产生 对氨基水杨酸钠常以间氨基酚为原料合成，成品中可能有未反应完全的间氨基酚；对氨基水杨酸钠又很不稳定，遇湿、光或遇热受潮时，失去CO2，生成间氨基酚，再被氧化成二苯醌型化合物，此化合物的氨基易被羟基取代而生成3,5,3’,5’-四羟基联苯醌，变成红棕色。间氨基酚的存在不仅导致变色，且有毒性，因此在检查项下进行限量控制。 1)双相滴定法 2)HPLC法 采用ion-pair HPLC法检查间氨基酚的限量。 为何采用ion-pair HPLC法？ 对氨基水杨酸钠具碱性，在水溶液中易离解；离子型化合物或能解离的化合物用常规HPLC分离时，常会出现色谱峰拖尾和保留值不稳定等问题，用离子对色谱则能解决以上问题。离子对色谱是将离子对提取与色谱技术相结合，适用于pKa在2-8的弱酸和弱碱性化合物的分离，其机理尚在研究发展中。通常使用反相ion-pair 色谱，因离子对试剂在极性流动相中易于溶解，并易于调整控制反离子的浓度和流动相的pH值。 色谱条件 色谱柱为C18柱，内径10m m（250mm×4.6mm）；流动相为NaH2PO4液（0.05mol/L）－Na2HPO4液（0.05mol/L）－甲醇（含氢氧化四丁基铵1.9g）（425: 425: 150）；检测波长为254nm；流速约1.5ml/min。 讨论 为何选用氢氧化四丁基铵？ 离子对试剂和其他添加剂的一般选用规则 ：①样品中含有-COOH,-SO3H基团时,选用的离子对试剂应是带正电荷的有机铵盐，以此增加样品阴离子在反相色谱中的保留值，选用的流动相一般都为甲醇/水；②除了加入离子对试剂外，还要加入磷酸盐或其他缓冲液，以控制流动相的酸度，从而使这些酸性官能团能完全解离，最大程度形成离子对；③样品中含有-NH2，-NH-基团或其他阳离子时，选用的离子对试剂应是烷基磺酸盐或硫酸盐；④样品中同时含有-NH2，-COOH，-SO3H等不同性质的基团时，则规则①②或③都适用。 本法中，鉴于对氨基水杨酸钠，间氨基酚以及内标磺胺的分子结构中具有-COOH，-OH和-SO3H基团，按规则①和②选用了离子对试剂氢氧化四丁基铵和磷酸盐缓冲液，调整了色谱保留行为，从而提高了样品保留值的重现性和色谱峰的对称性。 本实验流动相含有缓冲盐和离子对试剂，易损坏色谱柱和高压泵，故实验结束，即用甲醇－水－磷酸（77: 23: 0.6）混合液清洗色谱柱30min，再用甲醇－水（50: 50）混合液继续清洗30min。 USP(23)还采用类似方法测定对氨基水杨酸钠及其片剂的含量。 3、​ 羟苯乙中有关物质的检查 BP采用TLC法进行检查。 四、甲芬那酸中铜盐与有关物质的检查 铜盐采用分光光度法或原子吸收法 检查；相关物质采用TLC法进行检查。 五、氯贝丁酯中对氯酚的检查 合成是以对氯酚为起始原料，生产过程中的主要中间体为对氯苯氧异丁酸。合成工艺如下： 由于成品中可能存在中间体对氯苯氧异丁酸，放置过程中也可能分解产生对氯苯氧异丁酸；另外加入的试剂盐酸、硫酸等均可影响酸度。因此，在检查项下应控制其酸度。对氯酚为氯贝丁酯合成的起始原料，在成品中常有微量存在，因其毒性大，各国药典均采用气相色谱法检查对氯酚。合成过程中试剂等挥发性杂质的检查也采用气相色谱法。 采用GC法和HPLC法进行检查。 六、酚磺乙胺 1.合成工艺 二乙胺（乙醇水溶液）→通入SO2→亚硫酸二乙胺盐，→与苯醌缩合而得。 本品具有对苯二酚的结构，很易氧化，遇光更易氧化分解，应遮光，密封保存，否则产生分解杂质影响本品质量。 2. 杂质的确证 中国药典(1977年版)检查的有关杂质主要指生产中引入的原料苯醌，采用薄层色谱法，以苯醌为对照品控制供试品中含杂质的量，限量为0.1%。 经HPLC法考察酚磺乙胺纯度，发现其主要杂质的保留时间与苯醌对照品不同，而与氢醌相同，见图5-6，分离制备后测紫外吸收光谱，确证为氢醌。中国药典改用氢醌为对照品，检查杂质。因此，中国药典均采用高效液相色谱法来检查氢醌，灵敏度、准确度均较薄层色谱法好，限度为0.02%。 3. 氢醌的HPLC检查法 酚磺乙胺和氢醌的分子结构中均含有-OH具有较强的氢键作用力，宜选择强极性的极性键合相硅胶色谱柱。 色谱条件 用氨基键合硅胶为填充剂，甲醇－0.2％磷酸二氢钾溶液（10: 90）为流动相，检测波长为223nm。 系统适用性试验 在上述色谱条件下，理论板数按酚磺乙胺峰计算，应不低于800，酚磺乙胺峰和氢醌峰的分离度应大于1.5。 测定法 用外标法测定。取本品，加流动相溶解制成每1ml中含0.10g的溶液，作为供试品溶液；另取氢醌对照品，加流动相溶解制成每1ml中含有20mg的溶液作为供试品溶液。精密量取上述两种溶液各5ml，分别注入液相色谱仪，色谱图。供试品溶液如出现与对照品相应的氢醌峰，不得过0.02％。 小结 一、鉴别试验 1，​ 与铁盐的反应 2，​ 重氮化-偶合反应 3，​ 氧化反应 4，​ 水解反应 5，​ 分解反应 6，​ 紫外吸收光谱 7，​ 红外吸收光谱 二、特殊杂质检查 1，​ 阿司匹林中特殊杂质的检查 2，​ 对氨基水杨酸钠中特殊杂质的检查 3，​ 羟苯乙酯中有关物质的检查 4，​ 甲芬那酸中特殊杂质的检查 5，​ 氯贝丁酯中特殊杂质的检查 第四节 含量测定 一、酸碱滴定法 1．直接滴定法 阿斯匹林、双水杨酸酯、苯甲酸、丙磺舒、布洛芬均可采用此法测定含量，其原理基于游离羧基具有酸性。 阿司匹林结构中的游离羧基，可采用碱滴定液直接滴定。各国药典测定双水杨酯的含量也采用直接滴定法。 方法：取本品约0.4g，精密称定，加中性乙醇（对酚酞指示液显中性）20ml，溶解后，加酚酞指示液3滴，用氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）滴定。每1ml的氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）相当于18.02mg的C9H8O4。 讨论：（1）为何用中性乙醇为溶剂？---防止阿司匹林酯结构在滴定时水解，致使测定结果偏高，故不用水为溶剂。 （2）为何选用酚酞？--- 强碱滴定弱酸，化学计量点偏碱性，故选用碱性区变色的酚酞。 （3）滴定时应在不断振摇下稍快地进行，以防止局部碱度过大而促使其水解。 （4）供试品中所含水杨酸超过规定限度时，则不宜用直接滴定法测定。 2．水解后剩余滴定法 阿斯匹林、羟苯乙酯均可采用此法测定含量。 利用阿司匹林酯结构在碱性溶液中易于水解的性质，加入定量过量的氢氧化钠滴定液，加热使酯水解，剩余的碱用酸溶液回滴。 USP(23)方法：取本品约1.5g，精密称定，加入氢氧化钠滴定液（0.5mol/L）50.0ml，混合，缓缓煮沸10min，放冷，加酚酞指示液，用硫酸滴定液（0.25mol/L）滴定剩余的氢氧化钠，并将滴定结果用空白试验校正。每1ml的氢氧化钠滴定液（0.5mol/L）相当于45.04mg的C9H8O4。 讨论：空白试验？--碱液在受热时很易吸收CO2，用酸回滴定时会影响测定结果，故需在同样条件下进行空白试验校正之。 3．两步滴定法 阿斯匹林片、氯贝丁酯均可采用此法。 用于阿司匹林片和阿司匹林肠溶片的含量测定。片剂中除了加入少量酒石酸或枸橼酸稳定剂外，制剂工艺过程中又可能有水解产物（水杨酸、醋酸）产生，因此不能采用直接滴定法，而采用先中和与供试品共存的酸，再将阿司匹林在碱性条件下水解后测定的两步滴定法。 中和 精密称取片粉适量（约相当于阿司匹林0.3g），加入中性乙醇溶解后，以酚酞为指示剂，滴加氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）至溶液显粉红色。此时中和了存在的游离酸，阿司匹林也同时成为钠盐。 水解与测定 在中和后的供试品溶液中，加入定量过量的氢氧化钠滴定液（0.1mol/L）40 ml，置水浴上加热使酯结构水解，迅速放冷至室温，再用硫酸滴定液(0.05mol/L）滴定剩余的碱，并将滴定的结果用空白试验校正。 含量计算 ASA的标示量百分含量＝ 式中：V0为空白试验消耗硫酸量（ml）；V为剩余滴定时消耗硫酸量（ml）； M为硫酸滴定液的浓度（mol/L）； W为供试品片粉量（g）； 为平均片重（g）。 二、亚硝酸钠滴定法 对氨基水杨钠具有游离的芳伯氨基。 三、双相滴定法 苯甲酸钠可采用此法测定 苯甲酸钠为芳酸碱金属盐，易溶于水，其水溶液呈碱性，可用盐酸滴定液滴定，但在滴定过程中析出的游离酸不溶于水，并且使滴定终点的pH突跃不明显，不利于终点的正确判断。因此，利用苯甲酸能溶于有机溶剂的性质，在水相中加入与水不相混溶的有机溶剂，并置于分液漏斗中进行滴定反应，将滴定过程中产生的苯甲酸不断萃取入有机溶剂层中，减少苯甲酸在水中的浓度，使滴定反应完全，终点清晰，同时可降低苯甲酸的离解。 方法：取本品1.5g，精密称定，置分液漏斗中，加水25ml、乙醚50ml及甲基橙指示液2滴，用盐酸滴定液（0.5mol/L）滴定，随滴随振摇，至水层显橙红色，分取水层，置具塞锥形瓶中，乙醚层用水5ml洗涤，洗液并入锥形瓶中，加乙醚20ml，继续用盐酸滴定液(0.5mol/L)滴定，随滴定随振摇，至水层显持续的橙红色。每1ml的盐酸滴定液（0.5mol/L)相当于72.06mg的C7H5NaO2。 四、紫外分光光度法 1．​ 直接紫外分光光度法 丙磺舒及其片剂采用此法测定。 2．​ 离子交换后紫外分光光法 氯贝丁酯采用此法测定。 3．​ 柱分配色谱-紫外分光光法 阿司匹林制剂的含量测定方法除了两步滴定法和高效液相色谱法外，USP(23)测定阿司匹林胶囊的含量采用柱分配色谱-紫外分光光度法，经柱色谱分离后，可同时定量测定阿司匹林和水杨酸。 柱分配色谱法(CPC)是一种简便快速的色谱方法，尽管其分辨率低于气相色谱法、高效液相色谱法和薄层色谱法，但定量准确度较薄层色谱法要高，可以分离较大量的样品，分离出的组分不仅可以用光谱法定量，有时也可用重量法等经典方法定量。柱分配色谱法也常用作分离净化方法。 1. 水杨酸的限量测定 原理：水杨酸与三氯化铁-尿素试剂生成紫色水杨酸铁配位化合物，保留于硅藻土色谱柱上，用氯仿洗脱阿司匹林，弃去洗脱液；再以冰醋酸-水饱和乙醚洗脱 ，紫色配位化合物解离，水杨酸游离出来，继而被氯仿洗脱。于306nm波长处测定吸收度。 方法：色谱柱的制备 于玻璃柱（20 cm×2.5cm）下端塞入少量玻棉，装入两种填充剂，下层为硅藻土1g和磷酸液（5mol/L）0.5ml的混合物，上层为硅藻土3g和新制三氯化铁－尿素试剂 [取尿素60g溶于三氯化铁液(6® 10)8ml和盐酸液(0.05mol/L)42ml混合液中，必要时用盐酸液调节溶液至pH3.2。]2ml的混合物。 对照品溶液的制备 取水杨酸对照品配成75m g/ml氯仿溶液为贮备液。 供试品溶液的制备 取胶囊内容物适量（相当于阿司匹林100mg），精密称定，加入氯仿10ml，搅拌3分钟后，转移入色谱柱填充剂上，并用氯仿数毫升洗净容器后，一并移入柱内。用氯仿50ml分数次洗脱，并弃去之。再用冰醋酸－水饱和乙醚（1® 10）10ml洗脱水杨酸，收集洗脱液于已盛有甲醇10 ml，盐酸2滴的50ml量瓶中，继用氯仿30ml洗脱，并用氯仿稀释至刻度。 测定法 于306nm波长处，1cm吸收池中，以配制对照品溶液的溶剂为空白，测定对照品溶液和供试品溶液的吸收度，后者不得超过前者的吸收度，即按阿司匹林标示量计,允许水杨酸限量为0.75％。 讨论：（1）洗脱时，若有三氯化铁被洗下，则使洗脱液带黄色，影响测定结果，故在色谱柱下层加入拌有磷酸的硅藻土，与Fe3+生成不溶于洗脱液的磷酸铁而避免干扰。 （2）在洗脱SA时，可能有尿素被洗下，故接收液中加入适量盐酸保持酸性。 （3）制备供试液以及整个操作宜快，避免ASA水解。 （4）若紫色环谱带扩散，可能样品量大，则应重新填装色谱柱。 2. 含量测定 原理：在硅藻土－碳酸氢钠色谱柱中，阿司匹林及水杨酸成钠盐保留于柱上，先用氯仿洗脱除去中性或碱性杂质，再用醋酸酸化，使阿司匹林游离，被氯仿洗脱后测得其含量。 方法：色谱柱的制备 填充剂为硅藻土3g和新制碳酸氢钠液（1® 12）2ml的混合物。 以下测定中所用氯仿均应在临用前用水饱和。 对照品溶液浓度为50m g/ml，冰醋酸－氯仿(1® 100)液为溶剂。 供试品溶液的制备 取胶囊20粒，尽可能完全倾出内容物，精密称定，研细，混匀；取适量细粉（相当于阿司匹林50mg)，精密称定，置于已盛有盐酸甲醇液（1® 50）1ml的50ml量瓶中，加氯仿至刻度，混匀。精密量取此液5ml转入色谱柱填充剂上，用5ml、25ml氯仿相继洗脱后弃去，立即用冰醋酸－氯仿（1® 10）液10ml洗脱，再用冰醋酸－氯仿（1® 100）液85ml洗脱，将洗脱液收集于100ml量瓶中，并用后者溶剂稀释至刻度，混匀。 测定法 于280nm波长处，1cm吸收池中，以氯仿为空白，立即测定对照品溶液和供试品溶液的吸收度，用下式计算所取胶囊内容物细粉中含有阿司匹林的量（mg）： 所取胶囊细粉中C9H8O4(mg )＝C（AU/AS） 式中C为阿司匹林对照品溶液浓度（m g/ml）； AU和AS分别为供试品溶液和对照品溶液的吸收度。 柱分配色谱－紫外分光光度法不需特殊仪器，结果重现性较好，但操作较繁琐。 （1）阿斯匹林胶囊中水杨酸的限量测定 （2）阿斯匹林胶囊中阿斯匹林的量测定 五、HPLC法 为分离原料药和制剂中的杂质、辅料以及稳定剂等，中国药典采用高效液相色谱法测定阿司匹林栓剂；USP(23)用于测定对氨基水杨酸钠及其片剂，阿司匹林片剂，长效与缓冲片剂，缓释胶囊等。 1．​ 阿斯匹林栓剂的含量测定 2．​ 丙磺舒原料的含量测定 第五节 体内药物分析 一、血清中阿司匹林和水杨酸浓度的HPLC法 近年来，临床上已经确认，低剂量服用阿司匹林可抑制血小板过度凝集的疾病，如心肌梗塞和手术后的深部静脉血栓形成；并有预防缺血性脑血管病的作用，由于ASA的服用剂量小，而且易水解，因此可采用反相高效液相色谱法快速、灵敏地同时测定人血清中ASA和SA的浓度。 二、尿中丙磺舒的固相萃取净化-HPLC法 生物体液中丙磺舒及其制剂的含量测定，常采用HPLC法。但生物样本净化若应用液－液萃取，需要多次提取操作，分析时间长。高效液相色谱分析中，大多在流动相中利用离子对试剂或磷酸盐缓冲剂。而要获得重现性好的结果，一定要严格控制实验条件，特别是pH值、离子强度和温度。另一方面，因为丙磺舒色谱峰不对称且灵敏度低，样品测定检测限为0.25mg/ml～10mg/ml。这样，不能检测服药24h后的药物浓度。 为了评价尿样中丙磺舒对运动员违禁药物尿排泄的作用，可采用固相萃取净化－高效液相色谱法进行快速、灵敏的测定。 色谱条件 对照品溶液的制备 尿样的处理 C8固相萃取柱，100mg填料/ml用甲醇1.0ml，然后用0.5ml蒸馏水使活化。内标物甲醇溶液（10m g/ml）300m l加入2.0ml尿中，样品通过柱子后，用蒸馏水1.0ml洗去生物基质。再用甲醇0.5ml洗脱柱子，所得药物和内标物的洗脱液经0.45m m滤膜滤过，取5m l进样分析，得色谱图。 曲线和回收率测定 人尿样品测定 采用固相萃取技术净化丙磺舒尿样，样品预处理省时，回收率高，高效液相色谱分离时间在6min内，并可见保留时间为3min～4min内出现的色谱峰为丙磺舒的代谢产物，因而也为进一步研究丙磺舒代谢物结构及体内过程等打下了基础。 三、HPLC法测定血浆中布洛芬含量 小结 一、酸碱滴定法 1，​ 直接滴定法 2，​ 水解后剩余滴定法 3，​ 两步滴定法 二、双相液滴定法 三、紫外分光光度法 1，​ 直接紫外分光光度法 2，​ 离子交换-紫外分光光度法 3，​ 柱分配色谱-紫外分光光度法 四、高效液相色谱法 五、体内药物分析 本章小结 1、本类药物的结构特征和理化性质 2、本类药物鉴别反应 （1）FeCl3反应：反应条件及产物颜色； （2）水解反应：试剂与现象； （3）重氮化偶合反应 （4）紫外吸收光谱 （5）红外吸收光谱 3、阿司匹林和对氨基水杨酸钠的特殊杂质检查方法： （1）游离水杨酸的检查：来源及检查原理； （2）间氨基酚的检查：来源及检查原理； 4、本类药物的酸碱滴定法，其他含量测定方法： （1）两步滴定法：原理、注意事项； （2）双相滴定法：原理 5、体内药物分析 [练习题及] 一、练习题 [A型题] 1．阿斯匹林中检查的特殊杂质是 A.水杨醛 B.砷盐 C.水杨酸 D.苯甲酸 E.苯酚 2．对氨基水杨酸钠中检查的特殊杂质是 A.水杨醛 B. 间氨基酚 C.水杨酸 D.苯甲酸 E.苯酚 [B型题] A. FeCl3反应 B.水解后FeCl3反应 C. AgNO3反应 D.重氮化-偶合反应 E. 麦芽酚反应 1. 阿斯匹林 2. 水杨酸 3. SMZ 4. 苯甲酸钠 A. 直接酸碱滴定法 B. 两步酸碱滴定法 C. 亚硝酸钠溶液滴定法 D. HPLC法 E. 双相滴定法 5. 苯甲酸钠 6. 阿斯匹林 7. 阿斯匹林栓剂 8. 对氨基水杨酸钠 [X型题] 1. 直接能与FeCl3产生颜色反应的药物有 A. 水杨酸 B. 盐酸普鲁卡因 C. 对氨基水杨酸钠 D. 对氨基酚 E. 阿斯匹林 2. 能发生重氮化-偶合反应的药物有 A. 水杨酸 B. 阿斯匹林 C. 对氨基水杨酸钠 D. 对氨基酚 E. 盐酸普鲁卡因 二、答案精讲 [A型题] 1．C 因为阿斯匹林在生产和贮藏过程中, 易引入游离水杨酸杂质, 只能选C。 2. B 因为对氨基水杨酸钠中检查的特殊杂质是间氨基酚，只能选B。 [B型题] 1.B 2.A 3.D 4.A 5.E 6.B 7.D 8.C [X型题] 1.A C D 因为直接能与FeCl3产生颜色反应的药物，要求分子结构中含有酚羟基，故选A，C，D。 2. C D E因为能发生重氮化-偶合反应的药物，要求分子结构中含有芳伯氨基基，故选C，D，E。 练习题 98：80．鉴别水杨酸及其盐类，最常用的试液是（C） A. 碘化钾 B. 碘化汞钾 C. 三氯化铁 D. 硫酸亚铁 E. 亚铁氰化钾 95：129. 乙酰水杨酸片剂可采用的测定方法为（CD） A. 非水滴定法 B. 水解后剩余滴定法 C. 两步滴定法 D. 柱色谱法 E. 双相滴定法 98：134．测定阿司匹林片和栓中药物的含量可采用的方法是（BC） A. 重量法 B. 酸碱滴定法 C. 高效液相色谱法 D. 络合滴定法 E. 高锰酸钾法 99：81. 两步滴定法测定阿司匹林片的含量时，每1ml氢氧化钠溶液（0.1mol/L）相当于阿司匹林（分子量=180.16）的量是（A） A. 18.02mg B. 180.2mg C. 90.08mg D. 45.04mg E. 450.0mg 反应摩尔比为1∶1 T——滴定度，每1ml滴定液相当于被测组分的mg数 c——滴定液浓度，mol/L M——被测物的摩尔质量，g/mol n——1mol样品消耗滴定液的摩尔数，常用反应摩尔比体现，即反应摩尔比为1∶n 96：78．苯甲酸钠的含量测定，中国药典（1995年版）采用双相滴定法，其所用的溶剂体系为（D） A. 水—乙醇 B. 水—冰醋酸 C. 水—氯仿 D. 水—乙醚 E. 水—丙酮 99：83. 双相滴定法可适用的药物为（E） A. 阿司匹林 B. 对乙酰氨基酚 C. 水杨酸 D. 苯甲酸 E. 苯甲酸钠 99x：[121—125]含量测定方法（中国药典1995年版）为 A. 直接中和滴定法 B. 两步滴定法 C. 两者均可 D. 两者均不可 99x：121．阿司匹林片（B） 99x：122．阿司匹林原料药（A） 99x：123. 对氨基水杨酸钠（D） 99x：124. 阿司匹林栓剂（D） 99x：125. 阿司匹林肠溶剂（B） 例[1～5] A．两步酸碱滴定法 B．直接酸碱滴定法 C．两者皆是 D．两者皆不是 1. 苯甲酸钠的测定（D） 2. 氯贝丁酯的测定（A） 3. 盐酸的测定（B） 4. 酸碱滴定法（C） 5. 阿司匹林片的测定（A） 例6. 采用直接酸碱滴定法测定阿司匹林的含量时，已知阿司匹林的分子量为180.2，所用氢氧化钠滴定溶液的浓度为0.1mol/L，请问1ml氢氧化钠滴定溶液相当于阿司匹林的量应是（C） A. 180.2mg B. 180.2g C. 18.02 mg D. 1.802mg E. 9.01mg 例7. 阿司匹林加碳酸钠试液加热后，再加稀硫酸酸化，此时产生的白色沉淀应是（C） A. 苯酚 B. 乙酰水杨酸 C. 水杨酸 D. 醋酸钠 E. 醋酸苯酯 例8. 水杨酸与三氯化铁试液生成紫堇色产物的反应，要求溶液的pH值是（D） A. pH10.0 B. pH2.0 C. pH7～8 D. pH4～6 E. pH2.0±0.1 例9. 两步滴定法测定阿司匹林片或阿司匹林肠溶片时，第一步滴定反应的作用是（B） A. 测定阿司匹林含量 B. 消除共存酸性物质的干扰 C. 使阿司匹林反应完全 D. 便于观测终点 E. 有利于第二步滴定 例10．对氨基水杨酸钠中的特殊杂质是（B） A. 水杨酸 B. 间氨基酚 C. 氨基酚 D. 苯酚 E. 苯胺 例11. 能用与FeC13试液反应产生现象鉴别的药物有（ABC） A．苯甲酸钠 B．水杨酸 C．对乙酰氨基酚 D．氢化可的松 E．丙酸睾酮 例12. 采用双相滴定法测定苯甲酸钠含量时，加入乙醚的目的是（A） A. 防止反应产物的干扰 B. 乙醚层在水上面，防止样品被氧化 C. 消除酸碱性杂质的干扰 D. 防止样品水解 E. 以上都不对 例13. 采用双步滴定法测定阿司匹林制剂含量时，被测组分与标准溶液的反应摩尔比为（C） A. 2:1 B. 1:2 C. 1:1 D. 3:1 E. 以上都不对 例14. 阿司匹林中含量最高的杂质为（C） A. 乙酰水杨酸酐 B. 乙酰水杨酸水杨酸 C. 水杨酸 D. 水杨酰水杨酸 E. 以上都不对 例15. 区别水杨酸和苯甲酸钠，最常用的试液是（C） A. 碘化钾 B. 碘化汞钾 C. 三氯化铁 D. 硫酸亚铁 E. 亚铁氰化钾 例16. 在中性条件下，可与三氯化铁试液反应，生成赭色沉淀的药物是（D） A. 水杨酸钠 B. 对氨基水杨酸钠 C. 乙酰水杨酸 D. 苯甲酸钠 E. 扑热息痛 例17. 对氨基水杨酸钠的含量测定方法有（ABCDE） A. 离子对高效液相法 B. 非水滴定法 C. 溴量法 D. 亚硝酸钠滴定法 E. 以上都对 例18. 用直接滴定法测定阿司匹林含量（ABE） A. 反应摩尔比为1：1 B. 在中性乙醇溶液中滴定 C. 用盐酸滴定液滴定 D. 以中性红为指示剂 E. 滴定时应在不断振摇下稍快进行