红茶色素形成机理的研究

茶 叶 科 学 1999，19(2)：139一J44 j0I∞诚 ofTea sck雉ce 文章编 号 ：10~--369X (1999)02----O139---~ 红 茶 色 素 形 成 机 理 的 研 究 。 夏 涛 7一f 学 啊 丽 ’音 23㈣6 T 7 摘要 在茶鲜叶匀浆悬浮发酵体系中，如人铜酶抑制剂 NaDDc可使茶黄索 (Ⅱ )的总量下降， 而其各组分的消长趋势则各异，然而对茶红素 ('rRs)的形成 似乎井 无明显 的影 响 (高浓度 的 NaDDC除外)．表明 TRs的形成存在多条平行选径；在发酵体系中加^不同比例蒸青叶 (酶 已钝 化 )的试 验表 明 ，对 TFs和 TRs的形成 量未 产生影 响 ．说 明 酶浓度 不是红 茶发 酵 的限制 因子 ；降 低发酵体系的 pH (pH=4 0)，虽然使多酚氧化酶 (Pro)和过氧化物酶 (POD)的稳定性明显下 降．且 PPO活性降幅大于 POD，但由于减缓了TFs的非酶性氧化消耗速率．因而 TFs的含量显著 增 加 。 美链词 ：红茶色素 形成机理 酶 pH值 中围分类 号 ：TS272 4 文献标 识 码 ：B Study On the Medmmsm of Black Tea Pigments Formation Xia T O 协 如，曲 q- _衄 曲 般 蜥 矿山枷 胍 、 ， 础 ￡ ．Het'ei 230036 Absh础 n I。 帅 D皿I。fllIe~ vlm (Ⅱ )d 工eas byI ；nhibition ofNa—dlethvl di曲加盯b删 (NaDI~)add— ed to the suspemion—fermented system of tea l哪f hn e衄 山 ut the v Ii0 of each p0nen c ofTFs showed diffe~enl [舢deIlcks．The I bi rIs(TRsj fom~tion~eemed 10 be no1．,dS~Oed by NaDI)C with the e~eeplion of hi曲er㈣ n — tion．NaDIr,．These show~ t1】al$ORI~ parollel pathways existed InIk Ttlsforr~alion ． Thefo~ fion ofTFs a|Id TRs not influenced by adding u proportions of steamed Eea]eaves(e~ymes inactivated)to m朋诅Iion svst It meanI that【l enzyme c0rloen a6nn wa5 not the major f~e'or~tteetlng the formation of bl~ek tea pigments．Al~ ugh the咖 一 lfili~of PPo arId pe唧Lidase(PODj deere~ed咄rLi丘candy under low pH value，especially the PPO acdvhY，the TFs cont— ent ir 4sed obvlou~y by decreasing the I：t~ll—enz3~mtie o~idative rate 0r'rFs Key w叫。ds ：BIaek lea ￡，nenb Mech＆【lism Enzyme pH value 原 稿收到 日期 ：1999---05---07 修政 稿收到 日期 ：J 08—30 基盒项 目：安 街省 自然科学 基金 和安静 省教委 自然科 学基金 资助项 目内锌之一 作者筒 秆 ：夏涛 (1962一)、安 徽酶 县^ 、安 徽 农业 大 学副 教 授 ．农学 博 L、主 要从 事 翩茶 工狸 和☆ 吊风球 化 学研 究 维普资讯 http://www.cqvip.com 茶 叶 科 学 19卷 0 前言 迄今为止 ，许多学者 已就红茶发酵机理 进行过广泛的探讨。。 。目前普遍认为红茶 发酵生化变化的主体是茶多酚经酶促氧化聚 合、缩舍反应 ，形成茶黄素类 (TFs)和茶 红素类 (TRs)，以及由邻醌引起的偶联氧化 反应 ，而多酚氧化酶 (PPO )和过氧化物酶 (P0D)的催化作用是红茶色素形成的关键。 然而，由于红茶发酵体系的复杂性及体外模 拟发酵体系的简单化，加上缺少良好的分析 手段，使得红茶发酵过程 中有关红茶色素形 成机理的研究受到一定的限制。茶鲜叶匀浆 悬浮发酵体 系不仅可用作红茶饮料生产工 艺，而且固其接近传统红茶发酵体系并具备 操作简便、易于监控等优点 ，从而成为研究 红茶发酵机制的 良好体系。本研究利用茶鲜 叶匀浆悬浮发酵体系，并借助 HPLC分析技 术对红茶色素形成机理展开了深入的探讨 ， 旨在进一步丰富制茶发酵理论，为完善茶鲜 叶匀浆悬浮发酵生产红茶饮料工艺提供必要 的理论依据 。 l 和方法 1．1 材料与处理 供试材料 为福鼎大自茶一芽二三叶新 梢，经室内自然萎凋 12 h后，置于 一20。C 下备用。 1．2 实验方法 1．2．1 悬浮发酵方法 除非特殊说明外，均参照前文 茶 鲜叶匀浆悬浮发酵方法，悬浮发酵 30 rain 后，加热终止发酵。定时检测有关指标 ，重 复 3次。 1．2．2 实验处理 于茶萎凋叶匀浆破碎前加入一定量铜酶 抑制剂二乙基二硫代氨基 甲酸钠 (NaDDC)， 测定其对悬浮发酵体系的初始 PPO活性和 摄氧率 (OUR)以及发酵过程 中溶氧 (DO) 浓度及红茶色素形成的影响。 茶萎凋叶蒸青处理 5 n后，再以一定 比例与萎捅叶配比进行匀浆悬浮发酵，测定 其对红茶色素形成的影响。 以磷酸盐缓冲液调节发酵体系 DH，测 定 pH对红茶色素形成的影响。 1．3 测定方 法 1．3．1 TFs、TRs含量测定 参 照 Roberts等 的方 法 测定 发 酵液 TFs、TRs含量。 1．3．2 TFs及儿萘素 组分 的 HPLC分析 参照文献[5j，取发酵液 5 ，13 000 drain离 心 10 rain，上清液经 0．45Ⅲ 膜过 滤 后进行 HPIE分析 。 分析条件：岛津 LC一10A型高效液相色 谱仪；色谱柱 Shim-pack CLS—ODS，150 rIIII1 x 6+0 nml；检测器为 UV280 nm 0．001 AUFS： 流动相 A为 2％乙酸 ，B为 乙腈 ，梯度 92％ A至 69％A 50 rain；流速为 1．5 ml／min。 1．3．3 pH对 PPO及 POD稳 定性 和 活性 影 响 的测 定 以 0．1 mol／L磷 酸 缓 冲 液 分 别 配 成 plt4．0、4．5，5．0、5 5和 6．0的酶 液提取 介 质，将所提取的各酶液置于 37℃下保温1 h， 按刘仲华等 的方法及愈创木酚法 分别测 定 PPO和 POD活性 ，了解 pH对酶的稳定性 影响；以0．1 moUL磷酸盐缓冲液配成 pH为 4．0、4．5、5．0、5．5和 6．0的 酶反 应 介 质 ， 按愈创术酚法测定 POD活性，以了解 PO D 最适反应 pH值。 1．3．4 摄 氧 率 (OUR)厦 溶氧 (DO)浓度 测 定 按文献[8j用 JPB．607型溶氧分 析仪测 定悬浮发酵液初始 OUR及发酵过程中DO浓 度 变化 。 2 结果与分析 维普资讯 http://www.cqvip.com 2期 夏 涛：红茶色素形成机理的研究 14 J 2．1 NalO1)C处理对红茶色素形成的影响 采用铜酶抑制剂 NaDDC对悬浮发酵体 系的酶 活性 进 行 处理 ，结 果 表 明，随 着 NaDDC浓度 的增 大 ，PPO 活性 和 初 始 OUR 逐步降低 ，其 中 OUR降幅比 PPO活性大 ， 这可能与 NaDDC还抑制了除 PPO外的其它 铜酶活性有关。由于 PPO活性被抑制 ，导 致红茶发酵的主要氧化产物之一——TFs的 形成受阻，其含量减幅几乎与 PPO活性受 抑程度 相同，而红茶发酵 的另一主要氧化产 物 TRs则只有在高浓度 NaDDC条件下才表 现出减少趋势 (表 1)。 裹 1 NaDI)C对 PPO活性、OUR和红茶 色素形成的髟响 Table I Effects ofNaDDC O1"1the PIG,activity。 OUR and the formation of black tea pigments 裹 2 NaDI)C对红茶色素形成量(xl0Il 髟响的 HPLC分 析 Table 2 HPI~ analysis o1"1the effects of NaDDC 0n theformation of black tea pigraents 注 表中数据为各化台物在 HPLC图谱上的峰面积 {280 nm) Note： Val showed the T area cf each eompoand at HPLC chromatograph f280 nm) HPLC的分析结果 显示 (表 2、图 1)， 经 10 mg／g FW NaDDC处理 的悬浮发酵液中， TFs四种主要组分的总量为对 照的 74．8％， 其中 TF、TF_3_G降幅较大，分别 为对照的 58．3％和 58．I％．而 TF一3 一G+TF一3，3 一DG 却比对照高出 26．3％。与此 同时，经 NaD— DC处理后，发酵液中 EGCG、EGC、ECG等 主要儿茶素组分 的含量明显降低，尤其是 EGCG含量 仅占对照 19．15％。而 GA含量反 比对 照增加 31．3％，这可能 与 EGCG大量消 耗有关 。 另外 ，因 NaDDC抑制 了 PPO的酶促氧 化作用，导致悬浮发酵体系初始 OUR下降， 从而使发酵体系的早期 DO浓度有所增大， 但是进入到发酵中后期，体系的 DO浓度的 增幅却逐渐降低 (图 2)。 0 5 l0 1 5 20 25 30 35 发酵时间(rain Fermenting time 、 围 2 NaDDC对发酵体系 DO浓度的髟响 Fig 2 Effect ofNaDBC onthe DO eoneenlration of ferraentafion system 2．2 酶浓度对红茶色素形成的影响 通过 NaDDC抑制作用可见 PPO活性与 Ⅱs的形成有着密切的关系。但有关发酵体 系中整体酶浓度对色素形成的影响如何，过 去则很少有这方面的报道。本实验采用不同 比例的蒸青叶与萎凋叶混合后进行匀浆悬浮 发酵，以观测相同底物浓度条件下不同酶浓 维普资讯 http://www.cqvip.com l42 茶 叶 科 学 9卷 量 量 毒 量 ； ； ； ； ； ； ； 主 ； ； ； ； ； ； ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ● ’ ● ● ● t ● 田 1 NIDDC处理对最浮发酵液影响的 HPLc色谱围 Fig 1 HPLC du maI。grams the suspension-fenne~ liqui~wj NaDDC treatnm~．t at 280 nm S：GA， t4：EGC， 17： EGCG．筠 ： ECG．51：TF，57：Tf．3-G．54：TF-3 -6+TF-3．3 DG，Tr：5： G^． 14： EGc． 18： EGGG．28： IⅪG．52：TF 55：TF-3 G．56、57：TF．3 -G+1T．3．3 -叭： 度对红茶 色素形 成 的影 响 研究 结果 表 明 ， 随悬浮发酵体系中蒸青叶比例的增加，发酵 液初始的 TFs含量便明显下降 ，而 TBs含量 反而略有增加 ；至发酵中后期 ，TFs和 低 含量与对照的水平相当 (表 3)。 裹3 发酵体累酶浓度对红茶色素彩成量的影响(％l Table 3 Effects of enzyme c0nD阻缸lli0n in fermentation svskm 0ntheformation of blacktea pigments 酶瓣度 色袁 发酵时间Yern~tin$time(mlD) En~me㈣ Ⅱ lion pigmeo~ 0 30 ∞ 2．3 pH对红茶色素形成的影响 HPLC分析结果显示，随着发酵体系 pH 值 的降低 ，TFs各组 分含量 明显 增加 ．但 反 映在 EGC、EGCG、EGG等主要儿茶索组分 的保留量上，则是 pH5．0的 pH4．0的 pH 5．6的 (表 4)，与 TFs的形成量并不完全同 步。 采4 不同 pH条件下发酵液的 HP'LC分析(xl0s1 Table 4 HPLC analysis of the fermentedⅡau0r wilh different pH v~ues 让 ：丧t}1数 蟾为各 化台 物在 HP[ c乜潜 旧 I一的蜂 机 (280 nm) Note： Values sh0w am e peak of ch eornpo~．d at HPLc cl⋯ pht28o nm) 。 ． 傩 。． ， 维普资讯 http://www.cqvip.com 2期 夏 涛：红茶色素形成机理的研究 为了探讨低 pH条件促进 TFs含量增加 的原因，本 实验对不 同 pH条件下 PPO及 POD的活性与稳定性进行了研究。研究结果 显示 (图 3、图4)，不论提取介质 pH值高 低，POD的最适 反应 pH仍在 4．5～5．0左 右；随着提取介质 pH的降低 ，POD的稳定 性呈逐 渐下 降 趋势 ，而 PPO的稳 定性 在 pH5．0时最好 ；pH4．0时 ，PPO及 POD的活 性分别只有 DH5．0条件下的 9％和 33％，表 明降低提取介质的 pH值对 PPO活性的影响 程度更大；当提取介质与反应介质 pH均在 5．0和 5．5时 ，POD活性几乎相 当。 。 鲁 p H 围 3 pH对 POD活 性的影 响 3 Effegt of pH O13the POD activity 3 讨 论 NaDDC可与 cu 生成螫台物，从而对 铜酶 PPO产生非竞争性抑制，改变了酶的 反应速度 。它主要抑制以邻苯二酚为底物 的 PPO，但能对以对苯二酚为底物的PPO起 促进作用 。茶鲜叶中存在多种 PPO同工 酶 ，可催化不同特异性底物形成不同的氧化 产物 。本实验结果表 明，NaDDC对 PPO 活性可产生明显的抑制作用，导致 TFs总量 相应减少，但是 中各组分却呈现出迥然 不同的消长趋势 ．这也许与 NaDDC对 PPO 。 图 4 pR对 PPO 殛 POD稳定 性的 影响 Fig． 4 Effects of pH 0n the stability of P and POD 各同工酶具有不同的影响作用 有关 。NaDDC 处理虽然使 TFs形成受阻，但对 TRs形成似 乎影 响不 大 ，说 明 TRs具有 多条平行形成途 径，且与 TFs问存在竞争关 系。当 NaDDC 阻碍了 TFs形成时，经由 TFs氧化聚合形成 TRs的量 也相 应减 少 ，但 TRs的其 它形 成途 径则可能得到加强 ，因而 TRs含量仍能保持 在相 当水 平 上 。另外 ，由于 NaDDC抑 制 了 PPO活性，致使发酵体 系初始 OUR降低及 DO浓度上升。但是进人发酵中后期，DO浓 度便呈下降趋势 ，说明后期 OUR有所增加。 产生此现象的原因，可能与 NaDDC促进某 些氧化酶 活性有 关 ，由此 也就引起 EGCG等 儿茶素的氧化消耗及 TF-3，3"-DG和 TRs等 氧化产物的形成。 与 NaDDC抑制 PPO活性相比，蒸青处 理则钝化了鲜叶中包括 PPO、POD等酶在内 的整体酶活性。有资料报道，在绿茶抽提液 中仅需添加 占其总量 7％的茶鲜叶匀浆即可 完成正常的酶促转化而获得 品质优 良的红 茶 。本实验结果显示，随着蒸青叶比例 的增大，发酵体系中的酶浓度便相应降低， 明显阻碍了佻 的形成初速度，但对发酵中 后期的TFs含量并无严重影响，说明此时发 维普资讯 http://www.cqvip.com 茶 叶 科 学 9卷 酵体系中的酶浓度高低并未成为红茶色素形 成的限制 因子。另外，从 N~DDC及蒸青两 种处理 方式 对 TFs形 成 的不 同作用 结果 看 ， PPO活性与 TFs形成确有密切关系，但若从 'ITs形成与消耗两方面考虑，PPO与其它酶 (如 POD)活性的相对比例对 TFs的积累则 显得更为重要。 有研究认为，降低发酵体系 pH可改变 儿茶素的氧化还原电位，使没食子儿茶素氧 化速率下降，而筒单儿茶素氧化速率则基本 保持不变，从而增加了 TFs的形成量 ” 。 本实验结果表明，当发酵体系 pH降至 4．0 时，TFs形成量大幅度增加，但没食子儿茶 素如 EGCG的氧化消耗却并未减少。在解释 红茶发酵后期 TFs含量下降的原因时，许多 研究基于 POD的最适 pH低于 PPO的结果 ， 认为红茶发酵后期 ，体系 pH降低对 POD活 性有利，导致 PPOIPOD活性 比下 降，从 而 引起 TFs氧化消耗增加” 。然而本研究发 现，即使发酵是在恒定 pH条件中进行 ，发 酵后期 TFs含量下降仍在所难免，只是在低 pH条件下 TFs降幅减小而已 。与茶汁生 理 pH (=5．6)相 比，pH4．O时 PPO与 POD 的稳 定性 均大 幅减低，且 PPO降 幅 大 于 POD，但 TFs含量却大幅增加。因此 ，仅从 PPOIPOD活性 比角度考虑就无法圆满解释低 pH条件下 TFs含量增加的现象。笔者曾运 用数理统计方法推知，发酵体系 pH条件的 改变对 TFs氧化消耗的贡献大于对其合成的 影响 。因此，降低发酵体系 pH值虽影响 到 TFs的酶促合成 ，但是通过减缓 TFs的非 酶促氧化消耗速率，反而促进了 TFs积累。 致谢 本试验在浙江大学童启庆教授和安徽 农业大学萧伟掸教授指导下完成，特致谢 忱。 参 考 文 献 l Rab s E A H on0咖 lmpoflaaee of Fhvono／d sLIbstanc· ：Th F口 e盯tatl帆 In：C,eissman T A The Chemisw)' of glavoaoid Compouads N yock：Pexgamon Press lac． 1962：帅 8— 5I2 2 Robertso~ A． e C~mistzy aTId Bi~heraistry of Black Tl酗 PT州 ucli邮— — e⋯ Vo]at1]~ ln：Willson KC．Clifford M N ed． Tea．Cudlivation to Consumption． LDndon： Chorpman and Ha1． 1992： 555—6ol 3 夏涛 ．商丽萍 茶鲜叶匀浆悬浮发酵 L¨艺参数 茶卅 科学，1999：19(1)：胛一53 4 跏 b目协 E A H．Smith R F The Pl】enolics ofM丑lI岫 u d Tl髓 s 【m 0∞mH口c Ev~uatioa Th Li~amrs J ScJ Food ．~rio ，I963： 14：689"--700 5 Bailey R C Numte~ H E， MeDo~'ell J． Use An HPLC ‰ [彻 ．彻 r—一 ^Ⅱ Defect~ in tbe Aaa]ys s of A Biack 1h Ligu~．J Sci Food A c ，19cA)：52：．509-- 525 6 刘忡华，施兆鹏 红茶树造中多酚氧化酶同工酶谱与 活性 的变化 茶卅科 学 ，1989；9 (2)：14l— I50 7 钟萝 茶叶品 质理 化分 析 上 海： 上海 科学 技 术 出版 社 ，1989：476—477 8 俞 俊棠 ，唐孝 宣 生物工 艺学 上 海：华 东 化 工学 院 出版社 ．1992：59 9 潭 杰 ，李月标．荔枝皋皮多酚氧化酶的都分 纯化厦 性 质 ．植 物生理学报 ，1984 (4)：339--345 l0 李明启，严挺，候任昭 还原羽和抻制莉对荔枝果皮 多 酚氧化 酶 活 性 的 影 响 植 物 生 理 学 报 ， 1980 (1 J： 99 一l02 ll Roberts E A H ．M M e Phcnolio sI‘ oeB ofMan— ufaetured Tea IV Enzymic Oxidation Indivldua]sLIbsⅡ日t曲 J Sci Food ^ c ．1959； 10： I67— 179 l2 固守和 建溶茶生物化学 ．北京：北京大 学出版社， 1990： 48 13 R A Eff~ts ofPhysioaJ and Chefm~l Co r~ tion9 I*'ilro Ox idation ofTea Catechlns．PhylochemistP： 1983(4)：鼬9—89fi ’ 14 DixM A．FaMey C J，Millia D J Fermen ration ofTea in Aqu~oas S~spension，；Ir~ueace 0f Tea Penfidass J Sci Food ^ c ， 1981：32：92O一 932 l5 夏辩 ．高丽萍 茶鲜叶匀浆悬浮发酵体系优化模型研 究 茶卅科 学，1999；19(1j：55--60 者 维普资讯 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