基因诊断与治疗

目录 第 二 十 一 章 基因诊断与基因治疗 Genetic Diagnosis and Gene Therapy 南方医科大学基因工程研究所 郭秋野 目录 基因变异致病类型 内源基因的变异： • 基因结构突变 • 基因达异常 外源基因的入侵： 基因诊断和基因治疗 遗传性疾病 肿瘤、心脑血管病等 （生殖细胞） （体细胞） 病毒感染性疾病：HIV、SARS、HCV、HPV 目录 第 一 节 基 因 诊 断 Genetic Diagnosis 目录 特点： 针对性强：病因学检测 特异性强：分子杂交技术 灵敏度高：PCR、分子杂交放大效应，样品量少 适应性强：内源、外源基因 早期快速诊断： 一、基因诊断的概念和特点 定义： 利用现代分子生物学和分子遗传学的技术 和方法，直接检测基因结构及其表达水平是否 正常，从而对疾病作出诊断的方法。 目录 二、基因诊断常用技术方法 （一）核酸分子杂交技术 （二）聚合酶链反应 (PCR) （三）基因测序 （四）基因芯片 目录 二、基因诊断常用技术方法 „ 限制性内切酶谱法 „ DNA限制性长度多态性(restriction fragment length polymorphism, RLFP)间接分析 （一）核酸分子杂交技术 核酸分子杂交技术原理： 目录 核酸分子杂交的流程示意图 待测核酸制备 滤膜上核酸固化 杂 交 去除未参与杂交的探针 检测杂交信号 制备探针核酸片段 探 针 标 记 加入标记核酸探针 目录 × MstⅡ酶切位点(GCTNAGG) 5´ 3´ 正常基因 5´ 3´ 突变基因 1.15kb 1.35kb 1.镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 0.2kb 正常β珠蛋白基因： 5’－CCTGAGG－3’ 镰刀型贫血 ： 5’－CCTGTGG－3’ 目录 ++ ﹣﹣ 1.15kb 1.35kb 0.2kb 正常人 突变携带着 患者 1.镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析 目录 „ DNA多态性：中性突变导致个体间核苷酸序列的差异 „ 限制性长度多态性分析： 突变发生在酶切位点上，酶切DNA片段不同长度 „ RFLP：孟德尔方式遗传，家族中，与某一疾病紧密连 锁，作为遗传标志，判定家族成员是否携带致病基因 „ 应用：甲型血友病、囊性纤维病变、苯丙酮尿症 2. DNA限制性长度多态性分析 目录 RLFP分析法 目录 单基因病---苯丙酮尿症I I 型型 病因：肝脏合成的苯丙氨酸羟化酶病因：肝脏合成的苯丙氨酸羟化酶 （Phenylalanina Hydrozylase,PAH）缺乏。缺乏。 主征：智力低下，尿有霉味主征：智力低下，尿有霉味 治疗：新生儿诊断明确后，即用低苯丙氨酸饮治疗：新生儿诊断明确后，即用低苯丙氨酸饮 食控制血中苯丙氨酸浓度，食控制血中苯丙氨酸浓度，改善脑子的发育，改善脑子的发育， 而而““危险期危险期””一过，病婴后来就基本正常。一过，病婴后来就基本正常。 PAHPAH仅存在于肝脏细胞中，在绒毛、羊仅存在于肝脏细胞中，在绒毛、羊 水细胞和胎儿血中均不表达，故不能通水细胞和胎儿血中均不表达，故不能通 过测定酶活力及代谢产物来进行过测定酶活力及代谢产物来进行PKUPKU的的 产前诊断只能依赖于家系分析，找出与产前诊断只能依赖于家系分析，找出与 PKUPKU致病基因相连锁的致病基因相连锁的RFLPRFLP，，进行基因进行基因 分析做出产前诊断分析做出产前诊断 目录 （二）聚合酶链反应 （polymerase chain reaction PCR） „ PCR定义：指由一对引物介导的基因或克隆 的特定DNA序列的酶促扩增的反应过程，是 DNA的体外扩增技术，本质是DNA的体外复制。 ¾ ——应用PCR技术可以使特定的基因或DNA片段在短短的2－3小时扩 增至百万倍。 目录 （二）聚合酶链反应 Kary Mullis research scientist in the 1980s at a California biotechnology company called Cetus co-winner of 1993 Nobel Prize 目录 PCR技术的基本原理 „ ①DNA的变性：94℃热变性，使DNA双链解 离成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应 作准备； „ ②模板DNA与引物的退火(复性)：55℃左右， 引物与模板DNA单链的互补序列配对结合； „ ③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在 TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原 料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制 原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保 留复制链 目录 PCR产物以指数形式增加，即Y = 2n (n 为循环次数) 目录 以爱滋病的临床 检测为例，简要 说明一下PCR在 病毒感染的基因 诊断中的应用。 组织中总RNA的提取 ↓ 利用反转录酶合成cDNA ↓ PCR反应： 反应缓冲液 模板（上述合成的cDNA） 底物（dATP,dGTP,dCTP,dTTP） 引物（爱滋病病毒特异性引物） TaqDNA聚合酶 50μl 循环：95℃，30sec（变性） ↓ 55℃，1min（退火）30循环 ↓ 72℃，1min（延伸） 目录 （三）基因测序技术 他们给DNA 的测序带来了一场革命，分享了1980年的诺贝 尔化学奖。后来Sanger法发展为自动化测序法，并为人类 基因组测序做出了卓越贡献。 Fred Sanger 发明的末端合成终止法 (sanger法) Walter Gilbert发明的化学裂解法 Maxam-Gillbert法 目录 末端合成终止法 (sanger法)原理 2‘,3’-双脱氧核苷三磷酸（ddNTP）与普通dNTP不同 之处在于其脱氧核糖的3‘位置少一个羟基，可在DNA聚 合酶作用下通过其5'三磷酸基团掺入到正在增长的DNA 链中，但ddNTP因缺乏3‘羟基而不能同后续的dNTP形成 磷酸二酯键，因此，当正在增长的DNA链末端碱基为 ddNTP时，则链延伸反应终止，不可能继续延伸。这样， 在DNA合成反应混合物的4种普通dNTP中加入少量的一 种ddNTP后，链延伸将与偶然发生却十分特异的链终止 展开竞争，反应产物是一系列的核苷酸链，其长度取决 于从用以起始DNA合成引物末端到出现过早链终止的位 置之间的距离，结果将产生4类寡核苷酸，它们分别终止 于模板链的每一个A、C、G或T的位置上。 目录 双脱氧链终止法的测序基础是以双脱氧核 苷三磷酸为循环测序反应的链终止剂。 目录 P OH ddNTP dNTP P OH OH P P P P OH 末端合成终止法 (sanger法)原理 目录 5’ 3’ 5’3’ 引物 模板DNA dNTP DNA聚合酶 ddATP ddTTP ddGTP ddCTP 末端合成终止法 (sanger法)原理 目录 末端合成终止法 (sanger法)原理 目录 目录 DNA自动测序结果 目录 （四）基因芯片技术 „ 快速、高通量、平行化、自动化 指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或者直 接将大量基因探针以显微打印的方式有序地固化于支 持物表面，然后与标记的样品杂交，通过对杂交信号 的检测分析，得出样品的遗传信息（基因序列及表达 的信息） 目录 （四）基因芯片技术 目录 1..芯片的制备 Gene probes （cDNA、DNA） substrate Ready-to-use microarray Oligo probes A G C T or arrayer 目录 Sample cells 1) Extract RNA or DNA 2) RT or PCR amplification 3) Fluorescent labeling Reference cells Sample ready combine Labeled RNA or DNA (Sample ) Labeled RNA or DNA (Reference) 2)1) 3) 1) 2) 3) 2.基因表达谱双色标记 目录 3.分子杂交 1) hybridize Apply sample 2) rinse 目录 4. 检测分析 Laser 1 Laser 2 Detector 1 Detector 2 Scanner 芯片的扫描芯片的扫描 目录 5.图 像 处 理 Detector 1 Detector 2 False-color differential image 目录 图 像 分 析 基因诊断方法 经典基因诊断 .限制性内切酶法 .RFLP分析法 .寡核苷酸分析法 优 点 缺 点 .特异基因诊断 .未知基因诊断 .直接，过程简单 .过程繁杂 .准确性低，过程繁 .条件严格 基因诊断进展 .PCR方法 .PCR-序列分析法 .DNA芯片技术 .简单、经济、敏感 .操作直接、准确 .集成度高、快速、并行 .假阳性高 .价格高 .尚无成熟产品问世 目录 三、基因诊断的应用 „ 遗传疾病 „ 肿瘤 „ 感染性疾病，传染性流行病 „ 判断个体疾病易感性 „ 器官移植组织配型 „ 法医学中个体识别、亲子鉴定 目录 小结 „ 基因诊断的定义 „ 基因诊断的特点 „ 基因诊断的常用技术 目录 第 二 节 基 因 治 疗 Gene Therapy 目录 定义 早期是指用正常的基因整合入细胞基因 组，以校正和置换致病基因的一种治疗方法。 目前广义上来讲是指将某种遗传物质转 移到患者细胞内，使其在体内发挥作用，以 达到治疗疾病目的的方法。 一、基因治疗的概念 目录 基因治疗的基本方法 基因矫正 (gene correction) 基因置换 (gene replacement) 基因增补 (gene augmentation) 基因失活 (gene inactivation) 目录 几种常见的基因失活技术 ① 反义核酸技术 ② 核酶技术 ③ 三链技术 ④ 干扰RNA技术 基因治疗的其他方法：如“自杀基因” 的应用，基因疫苗等 目录 二、基因治疗的基本程序 治疗性基因的选择 基因载体的选择 靶细胞的选择 基因转移 外源基因表达的筛选 利用在体中的标记基因 回输体内 病毒载体 非病毒载体 体细胞 生殖细胞 间接体内疗法 直接体内疗法 目录 目录 三、基因治疗的应用与展望 应用 展望 遗传性疾病、心血管疾病、肿瘤、 感染性疾病、神经系统疾病 进一步寻找切实有效的基因 精密调控外源基因在人体内的表达 体细胞移植和重建的生物学研究 减少外源基因对机体的不利影响 第 二 十 一 章 第 一 节� �基 因 诊 断�Genetic Diagnosis 二、基因诊断常用技术方法 二、基因诊断常用技术方法 核酸分子杂交技术原理： 核酸分子杂交的流程示意图 2. DNA限制性长度多态性分析� （二）聚合酶链反应�（polymerase chain reaction PCR） （二）聚合酶链反应 （三）基因测序技术 末端合成终止法 (sanger法)原理 （四）基因芯片技术 （四）基因芯片技术 三、基因诊断的应用 小结 第 二 节 � �基 因 治 疗�Gene Therapy