5-1DNA的粗提取与鉴定

nullnullnullnull　　构成生物体的遗传物质是什么？　　怎样才能将细胞内的遗传物质分离出来？ 讨论2：讨论１：nullnull 在NaCl溶液浓度低于0.14 mol/L时， DNA的溶解度随NaCl溶液浓度的增加而逐渐降低; 在0.14 mol/L时，DNA溶解度最小；当NaCl溶液浓度继续增加时，DNA的溶解度又逐渐增大。null〖思考2〗要使DNA溶解，需要使用什么浓度？要使DNA析出，又需要使用什么浓度？null 2mol/L浓度可使DNA溶解； 0.14mol/L浓度可使DNA析出。〖思考2〗要使DNA溶解，需要使用什么浓度？要使DNA析出，又需要使用什么浓度？nullnull将DNA和蛋白质进一步分离nullDNA对酶、高温和洗涤剂的耐受性①蛋白酶能水解蛋白质，但是对DNA没有影响 ②大多数蛋白质不能忍受60－80℃的高温，而DNA在80℃以上才会变性 ③洗涤剂可以溶解细胞的细胞膜，去除脂质和蛋白质,但对DNA没有影响null 〖思考4〗 提取DNA还可以利用DNA对酶、高温和洗涤剂耐受性原理。利用该原理时，应选用怎样的酶和怎样的温度值？null 蛋白酶，因为酶具有专一性，蛋白酶只水解蛋白质而不会对DNA产生影响。温度值为60～80℃，因为该温度值蛋白质变性沉淀，而DNA不会变性。 〖思考4〗 提取DNA还可以利用DNA对酶、高温和洗涤剂耐受性原理。利用该原理时，应选用怎样的酶和怎样的温度值？null DNA的鉴定null DNA的鉴定①DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。null①DNA与二苯胺（沸水浴）会染成蓝色，因此，二苯胺可以作为鉴定DNA的试剂。 ②甲基绿（绿色） DNA的鉴定null　　通过利用不同浓度NaCl溶液溶解或析出DNA，可以从细胞中提取DNA；再利用酒精进一步将DNA与蛋白质分离开来，达到提纯的目的；最后利用二苯胺试剂鉴定提取的物质是否是DNA。原理总结null实验设计（一）实验材料的选取 不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。你认为教材提供的材料中哪些不适合提取DNA？null实验设计哺乳动物血液和液体培养基中大肠杆菌。（一）实验材料的选取 不同生物的组织中DNA含量不同。在选取材料时，应本着DNA含量高、材料易得、便于提取的原则。你认为教材提供的材料中哪些不适合提取DNA？null实验设计 从核DNA数目来看，猪38条，鸡78条，哺乳动物血0条，猕猴桃58条，洋葱16条，豌豆14条，菠菜12条，大肠杆菌1条。请选择动植物材料各一种。（一）实验材料的选取null实验设计鸡血、猕猴桃。（一）实验材料的选取 从核DNA数目来看，猪38条，鸡78条，哺乳动物血0条，猕猴桃58条，洋葱16条，豌豆14条，菠菜12条，大肠杆菌1条。请选择动植物材料各一种。null（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液1.动物细胞null　　动物细胞的破碎较易，例如，在鸡血细胞液中加入一定量的蒸馏水，同时用玻璃棒搅拌，过滤后收集滤液即可。（二）破碎细胞，获取含DNA的滤液1.动物细胞null讨论为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？null讨论为什么加入蒸馏水能使鸡血细胞破裂？　　答：蒸馏水对于鸡血细胞来说是一种低渗液体，水分可以大量进入血细胞内，使血细胞胀裂，再加上搅拌的机械作用，就加速了鸡血细胞的破裂（细胞膜和核膜的破裂），从而释放出DNA。null2. 植物细胞null①植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜2. 植物细胞null讨论加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？null讨论加入洗涤剂和食盐的作用分别是什么？　　答：洗涤剂是一些离子去污剂，能溶解细胞膜，有利于DNA的释放；食盐的主要成分是NaCl，有利于DNA的溶解。null①植物细胞需要先用一定的洗涤剂和食盐溶解细胞膜2. 植物细胞②实例： 　　提取洋葱DNA时，在切碎的洋葱中加入一定的洗涤剂和食盐，进行充分的搅拌和研磨，过滤后收集研磨液null讨论　　如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？null讨论　　如果研磨不充分，会对实验结果产生怎样的影响？　　答：研磨不充分会使细胞核内的DNA释放不完全，提取的DNA量变少，影响实验结果，导致看不到丝状沉淀物、用二苯胺鉴定不显示蓝色等。null（三）去除滤液中的杂质　　为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理。null讨论　　此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？（三）去除滤液中的杂质　　为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理。null　　答：可能含有核蛋白、多糖和RNA等杂质讨论　　此步骤获得的滤液中可能含有哪些细胞成分？（三）去除滤液中的杂质　　为了纯化提取的DNA需要将滤液作进一步处理。null 一：30mL滤液＋35gNaCl→同方向搅拌，DNA溶解→加入蒸馏水→DNA析出→过滤得到过滤物→放到2mol/LNaCl溶液中溶解→DNA-NaCl溶解液 方案二：30mL滤液＋嫩肉粉（木瓜蛋白酶）→静置10～15分钟→DNA滤液 方案三：30mL滤液→60～67℃处理→过滤获得DNA滤液方 案　null讨论　　为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？null讨论 　　答：用高浓度的盐溶液溶解DNA，能除去高盐中不能溶解的杂质；用低盐浓度使DNA析出，能除去溶解在低盐溶液中的杂质。因此，通过反复溶解与析出DNA，就能够除去与DNA溶解度不同的多种杂质。　　为什么反复地溶解与析出DNA，能够去除杂质？null讨论　方案二与方案三的原理有什么不同？null讨论　方案二与方案三的原理有什么不同？ 方案二是利用蛋白酶分解杂质蛋白，从而使提取的DNA与蛋白质分开； 　　方案三利用的是DNA和蛋白质对高温耐受性的不同，从而使蛋白质变性，与DNA分离。null（四） DNA的析出与鉴定1. DNA的析出 在滤液中仍然含有一些杂质，怎样除去这些杂质呢？得到的DNA呈何颜色？null（四） DNA的析出与鉴定1. DNA的析出 在滤液中仍然含有一些杂质，怎样除去这些杂质呢？得到的DNA呈何颜色？ 滤液与等体积的冷却酒精混合均匀，静置2～3分钟，析出的白色丝状物就是DNA。DNA呈白色。null2. DNA的鉴定null2. DNA的鉴定　　 试管2支，编号为甲、乙→各加等量5mL的NaCl溶液→甲中放入少量白色丝状物，使之溶解→各加4mL二苯胺，混合均匀→沸水浴5min→观察颜色变化null3. 实验操作制备鸡血细胞液…………加柠檬酸钠，静置或离心破碎细胞，释放DNA… 加蒸馏水，同一方向快速搅拌过滤，除去细胞壁、细胞膜等溶解核内DNA………… 加入2mol/L NaCl溶液，同一方向缓慢搅拌nullDNA析出…………加蒸馏水至0.14mol/L，过滤，再溶解到2mol/L NaCl溶液中除去细胞质中的大部分物质DNA初步纯化………… 与等体积95％冷却酒精混合，析出白色丝状物除去核蛋白、RNA、多糖等DNA鉴定……………… 二苯胺，沸水浴，呈现蓝色null1、以血液为实验材料时，每100ml血液中需要加入3g柠檬酸钠，防止血液凝固。 2、加入洗涤剂后，动作要轻缓、柔和，否则容易产生大量的泡沫，不利于后续步骤的操作。加入酒精和玻璃棒搅拌时，动作要轻缓，以免加剧DNA分子的断裂，导致DNA分子不能形成絮状沉淀。 3、二苯胺试剂要现配现用，否则会影响鉴定的效果。null课题延伸　　本课题使用的洗涤剂是多组分的混合物，在严格的科学实验中很少使用。实验室提取高纯度的DNA时，通常使用十六烷基三甲基溴化铵(CTAB)、十二烷基硫酸钠(SDS)或吐温等化学试剂。